Сумма биотехнологии. Руководство по борьбе с мифами о генетической модификации растений, животных и людей

“Большая сероватая круглая туша, величиной, пожалуй, с медведя, медленно, с трудом вылезала из цилиндра. Высунувшись на свет, она залоснилась, точно мокрый ремень. Два больших темных глаза пристально смотрели на меня. У чудовища была круглая голова и, если можно так выразиться, лицо. Под глазами находился рот, края которого двигались и дрожали, выпуская слюну. Чудовище тяжело дышало, и все его тело судорожно пульсировало. Одно его тонкое щупальце упиралось в край цилиндра, другим оно размахивало в воздухе. Этот толстый молодой человек был незаконный сын знаменитого екатерининского вельможи, графа Безухого”.

Это один из возможных результатов вставки фрагмента с описанием марсианина из “Войны миров” в роман Толстого. Согласитесь, образ Пьера Безухова со щупальцем и капающей слюной шокирует. Результат вставки был бы не столь драматичным, если бы текст оказался между главами. В этом случае образ Пьера в воображении читателя остался бы прежним.

Контекст имеет огромное значение и для работы генов. Возьмем ген медузы, кодирующий зеленый флуоресцентный белок. Вставим его в геном дифтерийной палочки сразу за другим геном, кодирующим натриевый канал – белок, находящийся в мембране клетки и пропускающий ионы натрия. Бактериальная клетка начнет производить гибридный белок, который одновременно светится и является каналом. Если мы поместим такую клетку под специальный флуоресцентный микроскоп, то по свечению сможем узнать, в какой части клеточной мембраны расположены натриевые каналы. Если же ген флуоресцентного белка вставить за другим геном, например за геном калиевых каналов, то мы узнаем и их расположение. Подобные гибридные белки – своеобразные Безуховы-марсиане в нашей аналогии. В зависимости от контекста мы можем сделать марсианином Безухова, а можем Наташу Ростову или Андрея Болконского.

При вышеописанном встраивании одного гена за другим важно учесть несколько факторов. Рассмотрим последовательность кодонов AUG GUG CUC UUA. Здесь закодированы аминокислоты метионинвалин-лейцин-лейцин. Но данную последовательность нуклеотидов можно разбить на тройки кодонов по-другому: A UGG UGC UCU UA. Теперь здесь закодированы триптофан-цистеин-серин. Возможен и третий вариант разбиения данной последовательности на кодоны: AU GGU GCU CUU A. Глицин-аланин-лейцин.

Эти три варианта разбиения последовательности на кодоны называются рамками считывания. На практике синтез белка пойдет только по одной из трех рамок, потому что рибосома начинает синтез не со случайного места, а с конкретного старт-кодона. У эукариот обычно старт-кодоном выступает самый первый кодон AUG (ближайший к 5’-концу), он кодирует метионин. У прокариот, как правило, старт-кодоном выступает AUG, на расстоянии около восьми нуклеотидов от которого есть особая последовательность Шайна – Дальгарно. Обычно она содержит фрагмент AGGAGG. Генным инженерам важно понять, какая рамка считывания будет использоваться. Если мы хотим получить гибридный белок, оба гена должны оказаться в одной рамке считывания.

Кроме того, нужно учитывать, что первый ген, за которым мы встраиваем второй, имеет стоп-кодон. На стоп-кодоне синтез белка заканчивается, и дальнейшая последовательность нуклеотидов значения не имеет. Для того чтобы получился гибридный белок, нужно либо убрать этот стоп-кодон, либо вставить второй ген до него. Теперь, когда мы поняли, как создавать гибридные белки, давайте разберемся, как нам заставить бактерию производить чистый флуоресцентный белок.

Возьмем ген флуоресцентного белка и вставим его в геном бактерии между двумя другими генами, так чтобы он их не задевал. Для того чтобы ген работал, необходимо, чтобы с него считывалась молекула РНК. Для этого перед геном должен располагаться специальный участок, который называется промотор. Фермент РНК-полимераза связывается с промотором, а затем начинает перемещаться вдоль молекулы ДНК (строго в одном направлении, от 5’-к 3’-концу), синтезируя комплементарную молекулу РНК, которая впоследствии станет инструкцией для синтеза белка.

Место начала считывания РНК у бактерий определяется так: за 10 нуклеотидов до него должен быть участок с последовательностью, похожей на TATAAT, а за 35 нуклеотидов – участок, похожий на TTGACA. У эукариотических организмов все сложнее, и мы поговорим о них позже.

В предыдущем примере генной инженерии нас не волновало наличие промотора, ведь у исходного гена, к которому пристроили ген зеленого флуоресцентного белка, бактериальный промотор уже был. Промотор должен быть перед любым местом в геноме, с которого считывается РНК. Но у нашего гена медузы нет собственного бактериального промотора, и вставили мы его в произвольное место, а не туда, где он непременно есть. Необходимый промотор проще всего вставить сразу вместе с геном. Берем бактерий, выделяем из них ДНК, вырезаем из этой ДНК участок промотора, присоединяем промотор к гену медузы, а затем вставляем всю конструкцию в геном живой бактерии. Альтернативно промотор или конструкцию целиком можно синтезировать на специальном химическом синтезаторе.