Сумма биотехнологии. Руководство по борьбе с мифами о генетической модификации растений, животных и людей

Кроме мутационного подхода для создания новых форм светящихся белков, который использовали в лаборатории Цяня, есть еще один способ — поиск уже существующих в природе генов флуоресцентных белков (как это делал Доктор М). С этим подходом преуспели в лаборатории академика Сергея Лукьянова из Института биоорганической химии РАН. Ученые открыли ярко-зеленый флуоресцентный белок на щупальцах актинии Anemonia majano, желтозеленый белок на щупальцах мягкого коралла рода Zoanthus, сине-зеленый белок на полосах и красный белок на пятнах дисков «грибного коралла» Discosoma striata и другие белки[304]. Позже эксперименты с различными флуоресцентными белками и их мутантами позволили создать белок, со временем меняющий цвет флуоресценции от зеленого к красному[305]. При помощи этого белка можно изучать, как меняется локализация или концентрация в клетке других белков, соединенных с такими светящимися «молекулярными часами».

Еще одну замечательную идею с использованием флуоресцентных белков придумала группа молекулярных биологов из Гарварда во главе с Джефом Лихтманом и Джошуа Сейнсом. В 2007 году они опубликовали в журнале Nature статью о новом методе исследования связей между нервными клетками мозга — Brainbow™ (от слов brain — «мозг» и rainbow — «радуга», то есть «мозговая радуга»). Метод основан на том, что в результате особой рекомбинации в отдельных нервных клетках генетически модифицированного организма оказывается свой уникальный набор генов флуоресцентных белков. Разные соотношения красных, зеленых и синих белков создают уникальные цвета, поэтому отдельные нейроны и их отростки окрашиваются по-разному. Это позволяет создавать удивительной красоты изображения структур мозга и видеть, какие нервные клетки соединены отростками.

Но вернемся к нашей текущей задаче — создать работающую плазмиду с флуоресцентным геном. Сначала мы спланируем ее на компьютере, а потом рассмотрим, как получить соответствующую последовательность ДНК в пробирке. В конце мы перенесем плазмиду в бактерию. Давайте выберем предложенный ген GFP или его аналог, цвет и яркость которого нам больше подходят, и последуем дальше.

Кроме гена GFP, нам понадобится ген, придающий бактерии устойчивость к какому-нибудь антибиотику. Такие гены могут кодировать белки, разрушающие или инактивирующие антибиотик, не впускающие его в клетку и так далее. Примеров и механизмов устойчивости известно множество, причем от разных антибиотиков защищают разные механизмы. После того как мы генетически модифицируем наши бактерии, мы захотим избавиться от тех, которые модифицировать не удалось, и антибиотик нам в этом поможет.

Для того чтобы гены работали, к ним нужно подобрать правильные регуляторные участки — промоторы и операторы, о которых мы говорили, обсуждая «синтаксис жизни». Выбор промотора зависит от того, какой организм мы модифицируем и хотим ли мы, чтобы ген работал постоянно или при определенных условиях. У бактерий и эукариот РНК-полимеразы разные и используют разные промоторы. Для того чтобы ген работал в клетках бактерий, перед ним часто ставят промотор бактериофага T7. Бактериофаги пытаются заставить бактериальную клетку полностью переключиться на производство вирусных РНК и белков, поэтому их промоторы очень эффективные (сильные) — с прилежащих к ним генов считывается много РНК. Если мы используем промотор T7, в нашей плазмиде должен быть еще один ген, а именно ген РНК-полимеразы бактериофага Т7, которая будет этот промотор обслуживать (связывать). Этот ген можно поставить под обычный бактериальный промотор. Известно множество разных промоторов, как сильных, так и слабых, а их последовательности можно найти в открытых базах данных и в научных публикациях. Ниже приведена последовательность промотора T7.

Для того чтобы синтез РНК в конце наших генов останавливался, после генов желательно разместить участки, которые называются терминаторами. Достигнув их, РНК-полимераза будет отсоединяться, прекращая синтез РНК. Это как знак пунктуации — точка в конце предложения. Для завершения работы над плазмидой потребуется еще один участок, который называется «ориджин репликации» — место, куда садится бактериальная ДНК-полимераза. Только при наличии такого участка плазмида сможет размножаться внутри бактерий. Наконец, между различными генами мы вставим небольшие участки ДНК произвольных последовательностей, чтобы отделить гены друг от друга.

Проект нашей плазмиды готов — пора создавать ее в пробирке. Сделать это можно несколькими способами. В принципе можно заказать плазмиду у какой-нибудь биотехнологической компании, которая сделает ее по нашим чертежам, используя современное оборудование и методы. Когда-нибудь в будущем устройства для синтеза произвольных последовательностей ДНК, в том числе плазмид, станут доступными для большинства людей, но пока что эти приборы очень дорогие. Здесь, конечно, ощущается некоторое жульничество. Что это за генные инженеры, которые не могут сами взять и все собрать?