Для большего уединения святой поселился вдалеке от селения, в гробнице. В определенные дни его друг приносил ему скудную пищу. И здесь бесы, напав на подвижника с намерением убить его, нанесли ему тяжкие побои. Однако Господь не допустил смерти Антония. Друг святого, принесший по обычаю пищу, увидел его замертво лежащим на земле и отнес в селение. Святого сочли умершим и стали готовиться к погребению. Но преподобный глубокой ночью пришел в сознание и умолил своего друга отнести его обратно в гробницу. Твердость святого Антония была сильнее ухищрений врага. Приняв вид диких зверей, бесы вновь пытались принудить святого покинуть избранное им место, но он опять отогнал их силой Животворящего Креста. Господь подкрепил силы Своего угодника: в разгар борьбы с темными силами преподобный увидел спускавшийся к нему с неба светлый луч и воскликнул: «Где был Ты, милосердный Иисусе?.. почему с самого начала не явился исцелить мои раны?» Господь ответил: «Антоний! Я был здесь, но ждал, желая видеть твое мужество; теперь же, после того, как ты твердо выдержал борьбу, Я буду всегда помогать тебе и прославлю тебя во всем мире». После этого явления преподобный Антоний встал исцеленный от ран и готовый к новым подвигам. В это время ему было 35 лет.
Приобретя духовный опыт в борьбе с диаволом, преподобный задумал уйти в глубь Фиваидской пустыни и в полном уединении служить Господу трудом и молитвой. Он просил старца-подвижника (к которому обращался в начале своего иноческого пути) удалиться вместе с ним в пустыню, но старец, благословив преподобного на новый, до тех пор неизвестный вид подвига — отшельничество, по старческой немощи не решился ему сопутствовать. Преподобный Антоний ушел в пустыню один. Диавол пытался остановить его, бросая перед преподобным драгоценности и золото, но святой, не обращая на них внимания, прошел мимо. Дойдя до одной горы, преподобный увидел какое-то заброшенное огороженное строение и поселился в нем, заложив камнями вход. Тот же верный друг приносил ему дважды в год хлеб, а вода имелась внутри ограды. В полном молчании принимал преподобный приносимую пищу.
В полном уединении и непрестанной борьбе с бесами преподобный Антоний прожил 20 лет и обрел наконец спокойствие духа и мир в помыслах. Когда настало время, Господь открыл людям Своего великого подвижника. Преподобному предстояло наставить многих мирян и монахов и руководить иноками. Собравшиеся к ограде преподобного люди разобрали заграждавшие вход камни, проникли к святому Антонию и просили взять их под свое руководство. Вскоре гора, на которой подвизался святой Антоний, была окружена целым поясом монастырских обителей, и преподобный с любовью наставлял насельников, уча духовной жизни тех, кто пришел в пустыню спасаться. Он учил прежде всего постоянству в принятом на себя подвиге, неослабному стремлению угодить Господу, щедрому и бескорыстному отношению к трудам, понесенным ранее. Он убеждал не страшиться бесовских нападений и прогонять врага силой Животворящего Креста Господня.
В 311 году Церковь постигло испытание — жестокое гонение на христиан, воздвигнутое императором Максимианом. Желая пострадать вместе со святыми мучениками, преподобный Антоний покинул пустыню и пришел в Александрию. Он открыто служил мученикам в их заточении, присутствовал на суде и допросах, но мучители к нему даже не прикоснулись! Господу угодно было сохранить его на пользу христианам. По окончании гонения преподобный вернулся в пустыню и продолжал подвиги. Господь даровал Своему избраннику дар чудотворений: преподобный изгонял бесов и исцелял больных силой своей молитвы. Множество приходящих к нему людей препятствовало его уединению, и преподобный ушел еще дальше, в так называемую «внутреннюю пустыню», и поселился на вершине горы. Однако братия из пустынных монастырей разыскали преподобного и умолили его хоть изредка посещать их обители.
Еще раз преподобному Антонию пришлось покинуть пустыню и прийти к христианам в Александрию, чтобы защитить православную веру от ересей манихеев и ариан. Зная, что имя преподобного Антония почитается всей Церковью, ариане возвели на него клевету — якобы он придерживается их еретического учения. Прибыв в Александрию, преподобный Антоний всенародно, в присутствии епископа, проклял арианство. Во время своего недолгого пребывания в Александрии он обратил ко Христу великое множество язычников. К преподобному приходили языческие философы, желая своими умствованиями поколебать его твердую веру, но он простыми, убедительными речами привел их к молчанию.
Равноапостольный царь Константин Великий (+ 337, память 21 мая) и его сыновья глубоко почитали преподобного Антония и просили его посетить их в столице, но преподобный не пожелал оставить своих братьев-пустынников. В ответном послании он убеждал императоров не гордиться высоким положением и помнить, что и над ними есть Нелицеприятный Судия — Господь Бог.