Пробыв восемь лет послушником в Саровской обители, Прохор принял иноческий постриг с именем Серафим («Пламенный»), столь хорошо выражавшим его пламенную любовь ко Господу и стремление ревностно Ему служить.
В 1793 году, в возрасте тридцати девяти лет, преподобный Серафим был рукоположен в сан иеромонаха и продолжал служение в храме. После смерти настоятеля, отца Пахомия, преподобный Серафим, имея его предсмертное благословение на новый подвиг — пустынножительство, взял также благословение у нового настоятеля, отца Исаии, и ушел в пустынную келью, находящуюся в нескольких километрах от монастыря, в глухом лесу. Здесь стал он предаваться уединенным молитвам, приходя в обитель лишь в субботу, перед всенощной, и возвращаясь к себе в келью после литургии, за которой причащался Святых Тайн. Преподобный проводил жизнь в суровых подвигах. Свое келейное молитвенное правило он совершал по уставу древних пустынных обителей; со Святым Евангелием никогда не расставался, прочитывая в течение недели весь Новый Завет, читал также святоотеческие и богослужебные книги. Преподобный выучил наизусть много церковных песнопений и воспевал их в часы работы в лесу. Около кельи он развел огород и устроил пчельник. Сам себе добывая пропитание, преподобный держал очень строгий пост, ел один раз в сутки, а в среду и пятницу совершенно воздерживался от пищи. В первую неделю Святой Четыредесятницы он не принимал пищи до субботы, когда причащался Святых Тайн.
Святой старец в уединении настолько иногда погружался во внутреннюю сердечную молитву, что подолгу оставался неподвижным, ничего не слыша и не видя вокруг. Навещавшие его изредка пустынники — схимонах Марк Молчальник и иеродиакон Александр, — застав святого в такой молитве, с благоговением тихо удалялись, чтобы не нарушать его созерцания.
В летнюю жару преподобный собирал на болоте мох для удобрения огорода и питался только одной травой снытью, которая росла вокруг его кельи. К нему все чаще стали приходить, кроме братии, миряне — за советом и благословением. Это нарушало его уединение. Испросив благословение настоятеля, преподобный преградил к себе доступ женщинам, а затем и всем остальным, получив знамение, что Господь одобряет его мысль о полном безмолвии. По молитве преподобного дорогу в его пустынную келью преградили огромные сучья вековых сосен. Теперь только птицы, слетавшиеся во множестве к преподобному, и дикие звери посещали его. Преподобный из рук кормил медведя хлебом, который ему приносили из монастыря.
После смерти настоятеля отца Исаии, бывшего с юности преподобного его другом, он взял на себя подвиг молчальничества, совершенно отрекаясь от всех житейских помыслов для чистейшего предстояния Богу в непрестанной молитве. Если святому в лесу встречался человек, он падал ниц и не вставал, пока прохожий не удалялся. В таком безмолвии старец провел около трех лет, перестав даже посещать обитель в воскресные дни. Плодом молчания явилось для преподобного Серафима стяжание мира души и радости о Святом Духе. Новый настоятель, отец Нифонт, и старшая братия обители предложили отцу Серафиму или по-прежнему приходить в монастырь по воскресеньям для участия в богослужении и причащения в обители Святых Тайн, или вернуться в обитель. Преподобный избрал последнее, так как ему стало трудно ходить из пустыни в монастырь. Весной 1810 года он возвратился в обитель после пятнадцати лет пребывания в пустыни. Не прерывая молчания, он к этому подвигу прибавил еще и затвор и, никуда не выходя и никого у себя не принимая, непрестанно находился в молитве и богомыслии. В затворе преподобный Серафим приобрел высокую душевную чистоту и сподобился от Бога особых благодатных даров — прозорливости и чудотворения. Тогда Господь поставил Своего избранника на служение людям в самом высшем монашеском подвиге — старчестве.
25 ноября 1825 года Матерь Божия вместе с празднуемыми в этот день двумя святителями явилась в сонном видении старцу и повелела ему выйти из затвора и принимать у себя немощные души человеческие, требующие наставления, утешения, руководства и исцеления. Благословившись у настоятеля на изменение образа жизни, преподобный открыл двери своей кельи для всех.