Европа не собиралась спускать с рук туркам разгром крестоносцев: вторая половина XIV века отмечена непрестанными попытками взять реванш. В 1365 году папа Урбан V призвал к новому крестовому походу против неверных. Подготовку к нему возглавил король Кипра Петр I. Летом 1365 года у берегов Кипра собралась армада парусников, галер и транспортных судов, на борту которых находились рыцари и воины из разных стран Европы. Были там и галеры ордена Святого Иоанна. Турки не сомневались, что главный удар будет нанесен по Сирии. Однако корабли крестоносцев направились в сторону Александрии, остававшейся одним из красивейших и богатейших городов Северной Африки. Город был взят приступом, разграблен, предан огню и мечу. Крестоносцы с беспощадным варварством истребляли мирное население, не делая различия между мусульманами, христианами и евреями. Когда перегруженные богатой добычей корабли крестоносцев вернулись на Кипр, стало ясно, что любая попытка развить первый успех обречена на неудачу. Большая часть крестоносного воинства дезертировала. Однако арабы и турки надолго запомнили безжалостную резню, устроенную крестоносцами в Александрии. Через 60 лет они захватили и опустошили Кипр. С падением Кипра с карты Восточного Средиземноморья исчезло последнее латинское королевство, орден Святого Иоанна остался один на один с набиравшей силу державой турок-османов.
Воинственный дух рыцарей не позволял им сидеть на месте. Через два года после разграбления Александрии госпитальеры предприняли успешную морскую экспедицию к берегам Сирии. Десант, высаженный с орденских галер, вернулся с богатой добычей. С этих пор морские набеги на города Леванта, Египта и Малой Азии стали совершаться регулярно. Рыцари поняли, что лучший способ борьбы с превосходящим по численности противником — внезапное нападение.
Как видно, поколению иоаннитов конца XIV века не давали покоя рассказы отцов и дедов о крестовых походах — орден Святого Иоанна принял участие в последней попытке средневековой Европы возродить времена славы крестоносцев. Стотысячная армия под командованием старшего сына герцога Бургундского выступила в поход, намереваясь вытеснить турок с территорий, занятых ими за Дунаем. Крестоносцы лелеяли надежду повторить успех Первого крестового похода, пройдя через Анатолию до Иерусалима. Совместно с генуэзцами и венецианцами госпитальеры должны были обеспечить поддержку с моря. Орденский флот под командованием великого магистра Филибера де Найяка вошел в Черное море через Дарданеллы и Босфор и встал на якорь рядом с устьем Дуная. Однако в боевых действиях участвовать ему не пришлось. Огромная, но плохо организованная и крайне недисциплинированная армия крестоносцев была наголову разбита легкой кавалерией турок у города Никополиса.
Противостояние сразу нескольких противоборствующих сил до предела осложнило обстановку в Леванте. Особенно это почувствовалось после захвата Багдада войсками Тимура в 1392 году. В 1403 году госпитальеры, никогда не колебавшиеся перед заключением временных союзов со своими вчерашними врагами против нового могущественного противника, договариваются о совместных действиях с египетскими мамлюками. Согласно условиям соглашения, орден получал право открыть свои представительства в Дамиетте и Рамле и восстановить свой старый госпиталь в Иерусалиме. Эта договоренность с мамлюками принесла ордену почти четыре десятилетия мирной передышки. Тем не менее работы по возведению новых фортификационных сооружений на Родосе продолжались, а галеры регулярно выходили в море из порта Мандраччио.
К середине XV века военно-политическая ситуация меняется, и соотношение сил в Восточном Средиземноморье становится не в пользу госпитальеров. Взятие Константинополя в 1453 году победоносными войсками султана Мехмета II прозвучало для ордена сигналом смертельной опасности. Мехмет II был искусным полководцем, образованным человеком, знал несколько языков, и завоевание Родоса было для него лишь вопросом времени. Над госпитальерами нависла смертельная угроза.
И вот к крепости госпитальеров подошло семидесятитысячное войско султана. Великим магистром ордена был тогда Пьер д’Обюссон. Мощи турецкой армии он мог противопоставить только 600 рыцарей, включая оруженосцев, и от 1,5 до 2 тыс. человек наемных иностранных войск. На стороне рыцарей сражалось и местное население, которому раздали оружие. Количество рабов, также участвовавших в военных действиях, в те времена никто не учитывал.