Трещина в мироздании. Редактирование генома. Невероятная технология, способная управлять эволюцией

Помимо тонкой настройки генов путем “небрежной” (негомологичной) или точной (гомологичной) репарации, ученые приспособили CRISPR для вырезания или переворачивания больших фрагментов ДНК, что позволяет изменять гораздо более крупные участки генома. В рамках этого метода используется готовность клеток “пойти на все”, лишь бы восстановить целостность хромосомы. Вооружив Cas9 двумя разными направляющими РНК, исследователи могут запрограммировать CRISPR на разрезание хромосомы в двух соседних генах; клетка справляется с этим повреждением, собирая хромосому заново по одному из трех сценариев.

Создание инверсий или делеций в генах с помощью CRISPR

В этой ситуации клетке нужно соединить в два раза больше концов разорванных молекул, чем в случаях, которые мы рассматривали раньше. Первый способ это сделать – на максимальной скорости, одновременно, “склеить” молекулу сразу в двух местах. Впрочем, часто отрезок времени, в течение которого репарацию можно провести таким путем, очень незначителен, поскольку молекулы в клетке непрерывно хаотично перемещаются. Если участок ДНК между двумя точками, в которых молекула была разрезана, “уплывет” куда-нибудь в сторону, клетка будет действовать согласно плану Б – и соединит концы порванной ДНК без разделяющего их фрагмента, который перестал быть доступным. Этот способ репарации можно сравнить с методом, с помощью которого режиссеры монтажа раньше удаляли ненужные сцены из фильма. Они просто разрезали пленку в двух местах – перед началом и по завершении ненужной сцены, – затем запись этой сцены выкидывали, а оставшиеся два конца пленки склеивали один с другим.

Третий способ репарации предполагает инверсию вырезанного фрагмента ДНК. В данном случае вырезанная часть ДНК перемещается таким образом, что остается примерно на том же месте, но переворачивается на 180 градусов, так что ее передний конец теперь находится там, где располагался задний, и наоборот. Те же ферменты, что способствуют соединению концов, “вклеят” недостающий кусочек в ДНК невзирая на его ориентацию.

Существует и другая область применений CRISPR, не имеющая ничего общего с редактированием генов. Вместо того чтобы пользоваться возможностью CRISPR разрезать ДНК, ученые буквально ломают механизм – нарочно. Специально “выключая” молекулярные ножницы, они могут управлять геномом дистанционно – не внося перманентные правки в ДНК, а изменяя то, как эта ДНК считывается, транслируется и экспрессируется. Прямо как невидимые ниточки дают “кукловоду” практически полный контроль над движениями и действиями “марионеток”, эта нережущая версия CRISPR позволяет ученым управлять поведением клетки, тем, что она производит.

Основы этого “марионеточного управления” фактически были заложены в ходе ранних экспериментов с CRISPR-Cas9, проводившихся у меня в лаборатории. Белки обычно состоят из сотен или тысяч “кирпичиков” – аминокислот, большинство которых служит для придания молекуле определенной формы, а способность фермента катализировать определенные химические реакции определяется функциональными группами всего нескольких из множества входящих в его состав аминокислот. Когда Мартин Йинек впервые определял биохимические функции Cas9, он показал, какие конкретно аминокислоты расщепляют химические связи между звеньями каждой из цепей двойной спирали ДНК. Провоцируя такие мутации в гене сas9, чтобы эти аминокислоты заменились на другие, он создал версию соответствующего белка, абсолютно утратившую способность разрезать ДНК, но, что примечательно, по-прежнему способную взаимодействовать с направляющей РНК и прочно соединяться с комплементарными последовательностями ДНК. Мы разрушили структуру каталитического центра фермента, но инактивированный Cas9 все же сохранил некоторые из своих функций: он мог находить и фиксировать конкретные последовательности ДНК в геноме, только не был способен их разрезать. Похожую работу опубликовал Виргиниюс Шикшнис с коллегами[88].

Неподалеку от нас, в Калифорнийском университете в Сан-Франциско, организовывал собственную лабораторию Стэнли Ки, получивший степень доктора философии в Беркли. В ходе совместной работы с Джонатаном Вайссманом и Уэнделлом Лимом (оба они были профессорами Калифорнийского университета в Сан-Франциско) Стэнли продемонстрировал, что дезактивированная версия CRISPR тоже может найти применение в управлении геномом[89]. В отличие от обычной версии, редактирующей ДНК, версия Стэнли Ки позволяла ученым вносить временные изменения в геном: эти изменения не затрагивали последовательность нуклеотидов, но при этом влияли на то, каким образом экспрессируется генетическая информация. В частности, Ки преобразовал CRISPR в аппарат контроля экспрессии генов, способный “включать” и “выключать” их, выкручивать их чтение на максимум или опускать до минимального уровня – примерно как реостат регулирует яркость свечения лампочки.