Трещина в мироздании

В 1983 году, когда я все еще была студенткой Помона-колледжа в Калифорнии, Шостак на другом конце страны решил, что нашел ответ. Основываясь на результатах экспериментов по генетике дрожжей, он и его магистрантка Терри Орр-Вивер вместе с профессорами Родни Ротштайном и Фрэнком Сталем обнародовали смелую модель[33], согласно которой провоцирующим фактором – сигналом, запускающим процесс гомологичной рекомбинации, – было разрезание одной из двух хромосом, что приводило к двуцепочечному разрыву ДНК. Согласно этой модели, двуцепочечный разрыв и освободившиеся концы ДНК на месте разрыва были особенно подвержены слиянию, а располагающиеся по бокам их последовательности с гораздо большей вероятностью могли быть вовлечены в обмен генетической информацией с соответствующей хромосомой (или, в случае редактирования генома, – с соответствующей ДНК, которую предоставлял исследователь).

К тому времени как я пришла в лабораторию Шостака в 1986 году, он уже сменил центральную повестку своих исследований на изучение роли молекул РНК на начальных этапах эволюции жизни на Земле. Однако в лаборатории мы с коллегами обсуждали модель двуцепочечных разрывов, ее изящество и тот неприкрытый скепсис, с которым она была встречена в научном сообществе. Но с течением времени становилось все яснее, что эта модель согласуется с большим количеством экспериментальных данных. Механизм репарации двуцепочечных разрывов казался логичным не только в случае процесса гомологичной рекомбинации при формировании яйцеклеток и сперматозоидов, но и при рекомбинации, происходящей каждый раз, когда была повреждена ДНК. Все клетки подвержены разрушительным для ДНК воздействиям, будь то рентгеновское излучение или канцерогены, и надо отметить, что клетки весьма эффективно справляются с репарацией таких разрывов, не теряя при этом генетической информации. Согласно модели Шостака, этот процесс репарации зависел от возможности хромосом обмениваться фрагментами посредством гомологичной рекомбинации, и именно поэтому наличие двух копий хромосом является выгодной эволюционной стратегией. Любое повреждение одной из хромосом можно репарировать, просто скопировав соответствующую последовательность со второй хромосомы.

Если модель двуцепочечных разрывов верна и выводы, полученные на дрожжах, справедливы и для млекопитающих, возникает очевидная возможность улучшить эффективность редактирования генома: сделать надрез в ДНК в точности в том месте, где необходимо провести редактирование. Если предстоит заменить дефектный ген в геноме на исправленную копию, созданную в лаборатории, то сначала нужно понять, как разрезать дефектный ген, вызвав локальный двуцепочечный разрыв в ДНК, – а затем добавить исправленную копию гена. Клетка, “почувствовав” разрыв, попыталась бы восстановить повреждение, начав поиск соответствующей хромосомы для копирования, – тут-то ученые и “подсунули” бы ей синтезированный ген. По сути дела, можно было заставить клетку “подумать”, что повреждение ее ДНК произошло по естественным причинам, и предоставить ей новый фрагмент ДНК под видом второй хромосомы, которую клетка могла бы использовать для репарации поврежденного участка.

В 1994 году исследователи из лаборатории Марии Джесин в Мемориальном онкологическом центре имени Слоуна – Кеттеринга (Нью-Йорк) стали первыми, кому удалось “обмануть” таким образом клетки млекопитающих, – об этом прорыве я читала с большим интересом, находясь неподалеку, в Нью-Хейвене, куда я только что приехала после завершения работы постдоком в Боулдере. Мне было чрезвычайно интересно узнать об этой важной работе, которая была основана на предложенной моим научным руководителем модели двуцепочечных разрывов и выполнена исследовательницей, которая, как и я, была увлечена молекулами жизни.

Эксперименты по редактированию генома, проведенные Джесин, были оригинальными и новаторскими. Ее стратегия заключалась в введении в мышиные клетки ферментов, разрезающих геном и создающих двуцепочечные разрывы; одновременно с этим она добавляла в клетки фрагменты синтезированной ДНК (шаблоны для репарации), соответствующие разрезанной последовательности ДНК. Затем исследовательница проверяла, получилось ли у мышиных клеток восстановить поврежденную ДНК с помощью вставки шаблона для репарации. Проводя этот же самый эксперимент с добавлением фермента и без него, Джесин смогла проверить свою гипотезу, что искусственно созданный двуцепочечный разрыв повышал эффективность гомологичной рекомбинации.

Сложность заключалась в том, чтобы подобрать подходящий фермент, разрезающий геном только в одном определенном месте из миллиардов возможных вариантов. Чтобы решить эту проблему, Джесин остроумно позаимствовала часть молекулярного механизма из дрожжей: эндонуклеазу I-SceI[34].