В таком положении был и преемник Самойловича, Иван Степанович Мазепа, старик чрезвычайно умный, ловкий, образованный, приятный говорун в обществе. Петр очень любил его и вполне ему доверял, несмотря на то что на него был целый ряд доносов в измене; доносы эти по своей недоказанности только утверждали Петра в той мысли, что верный ему гетман имеет много врагов. Действительно, пока шведский король был далеко, странно было бы думать, что умный Мазепа захочет изменить русскому царю.
Но обстоятельства переменились: победоносный Карл приближался к русским границам с целью заключить мир в Москве, и сам Петр не считал достижение этой цели невозможным, ибо послал приказ укреплять Москву. Старый Мазепа не мог преодолеть искушения и, полагая невероятным, чтоб Петр с своим неопытным войском вышел победителем из борьбы, завел переговоры с Карлом и новым королем польским Станиславом Лещинским. Донос не замедлил: генеральный судья Кочубей прислал монаха в Москву с известием, что гетман хочет изменить, передаться ляхам; Петр не обратил никакого внимания на донос, в котором видел только мщение Кочубея за личную обиду, нанесенную ему Мазепою, ибо Кочубей не умел смолчать об этой обиде.
В начале 1708 года Кочубей повторил донос вместе с бывшим полтавским полковником Искрою. Повторение доноса, подобно прежним не подкрепленного никакими доказательствами, навело Петра на мысль, что изменяет не Мазепа, но Кочубей с товарищами, которым хочется свергнуть верного гетмана, чтоб завести смуту в Малороссии. Кочубей с Искрою были вызваны в Витебск, где подали новый, пространственный, но Дурно написанный донос. Между прочим, Кочубей доносил, что когда Мазепа был потревожен известием 'о скором приезде государя, то собрал вооруженных людей; конечно, писал Кочубей, Мазепа при этом имел намерение отстреливаться от государя. Искра объявил, что Мазепа имел намерение при этом убить государя или выдать неприятелю и что он.
Искра, слышал это от Кочубея, но Кочубей на очной ставке с Искрою отрекся, что никогда не говорил ему о намерении гетмана посягнуть на жизнь государя; Искра ссылался на жену Кочубея, свидетельницу разговора, Кочубей не признавался.
В то время при таких обстоятельствах употреблялась пытка. Искра на пытке сложил свою вину на Кочубея, которого обвинял в заговоре с разными лицами для низвержения Мазепы, а Кочубей на пытке объявил, что доносил на гетмана единственно по злобе, не зная за ним никакой измены. Дело по-тогдашнему было решено: Искра и Кочубей были выданы Мазепе и в июле 1708 года казнены.
На этот раз Мазепа избавился от беды, но положение его затруднялось все более и более, потому что он сделал из себя игрушку обстоятельств, военного счастья, был слабый между двумя борющимися сильными. Из боязни перед победоносным Карлом он вошел с ним в сношения, но в то же время не смел отложиться от Петра, ибо только вступление шведов в Украину могло спасти его от гнева царского. Шведскому королю он должен был обещать помощь казаков, а между тем не смел открыться казакам, не смел явно подговаривать их на шведскую сторону. Хитрость, притворство оставались для Мазепы единственными средствами выпутаться как-нибудь из затруднительного положения. Чтоб не начальствовать войском и не идти туда, куда царь прикажет, он притворился отчаянно больным; но когда Карл вступил в Украину, Мазепа выздоровел, двинулся с небольшим отрядом преданного ему войска, переправился через Десну, 26 октября объявил своему отряду об измене, 29-го соединился с Карлом.
Получив известие об уходе Мазепы, Петр издал манифест с извещением, что гетман изменил и заключил договор с Карлом и Станиславом Лещинским, чтоб Малороссию поработить по-прежнему полякам, а церкви Божий и святые монастыри отдать в унию. Но Петр действовал не одними манифестами: он двинул Меншикова к Батурину, и эта столица гетманская была взята приступом и разорена, после чего 6 ноября в Тлухове собралась казацкая рада, на которой был избран гетман стародубский полковник Иван Ильич Скоропадский, 12 ноября в Глухове малороссийское духовенство, а в московском Успенском соборе великороссийское предало Мазепу проклятию, и чучело его было повешено палачом. Новый гетман Скоропадский выдал универсал, в котором спрашивал малороссиян: «Чего можно ожидать нам, православным христианам, от короля шведского, чужеземца иноверного?
Если бы даже он и хотел защищать нас, то как он может это сделать из такой дали, из-за Балтийского моря? И как он может быть защитником церквей наших, будучи их противником?»