А через несколько дней Сапега, действовавший автономно от Тушинского вора, двинулся по направлению к Троицкому монастырю, надеясь захватить эту богатейшую обитель московских патриархов и перекрыть пути сообщения Москвы с северными областями государства. Против него царь выслал брата своего, Ивана, но приведенные им ратники были уже настолько деморализованы, что при первом же столкновении они, не желая воевать ни за царя московского, ни за царя тушинского, разбежались по домам ждать развязки борьбы. Сапега же, усиленный подошедшими отрядами Лисовского, рыскавшими по окрестностям Москвы в поисках добычи, продолжил путь к лавре, которой достиг 23 сентября. Монастырь уже в те времена представлял собой весьма внушительную крепость, не уступающую по своим сооружениям ни Смоленскому кремлю, ни Московскому. Так что рассчитывать на легкую добычу полякам не приходилось. Началась осада. Но если в других сражениях русские еще раздумывали, кого поддерживать: одного ли, другого ли царя, то здесь сомнений не было — они защищали Православную Русь и ее святыню — гроб преподобного Сергия. Несмотря на то что осаждавших насчитывалось около 30 тысяч при 63 орудиях, они ничего не смогли сделать с 2–3-тысячным гарнизоном защитников. Все атаки были отбиты, все подкопы разрушены, все пожары потушены. Более того, осажденные неоднократно предпринимали смелые вылазки за крепостные стены, нанося ощутимый урон противнику. Конечно, единичные случаи предательства со стороны защитников монастыря имели место — куда без этого? Но отрадно, что во время осады случился массовый переход в осажденную крепость 500 казаков во главе с атаманом Епифанцем. Правда, не обошлось в монастыре и без серьезных проблем, вызванных теснотой, недоеданием, отсутствием дров, болезнями, а также характерных для осажденных городов подозрений в измене и предательстве. На этой почве главный воевода князь Григорий Роща-Долгорукий конфликтовал не только с архимандритом Иоасафом и монастырской братией, но и со своим ближайшим помощником воеводой Алексеем Голохвастовым. Дело доходило до арестов, пыток и даже до подстрекательства к бунту, что и неудивительно для тех условий, в которых находились осажденные, потерявшие к весне 1609 года две трети своего состава. Тем не менее защитники лавры продолжали делать свое дело, отбиваясь на монастырских стенах и производя вылазки за пределы крепости. История сохранила для потомков имена особо отличившихся защитников: Ананий Селевин, стрелец Нехорошев, крестьянин Никифор Шилов.