В 1654 году он вернулся в родной Делфт, где затем жил до самой смерти. Купив лавку, он занялся торговлей. По ряду свидетельств, Левенгук дружил с художником Вермеером, а после его кончины стал его душеприказчиком. Знаменитым Левенгука сделало его необычное увлечение. И увлечение этого практичного, делового человека прославило его в веках.
Еще в молодости Антони научился изготовлять увеличительные стекла, увлекся этим делом и достиг в нем изумительного искусства. На досуге он любил шлифовать оптические стекла и делал это с виртуозным мастерством. Когда Левенгук впервые изготовил увеличительное стекло, точно неизвестно. Однако случилось это ещё в молодые годы. Голландия славилась своими мастерами, и увеличительные стёкла там в новинку не были. В те времена самые сильные линзы увеличивали изображение лишь в двадцать раз. Новым явилось применение, которое нашёл Левенгук собственноручно изготовленному прибору, названному им «микроскоп». «Микроскоп» Левенгука — это, по существу, очень сильная лупа. Она увеличивала до 250–300 раз. Такие сильные увеличительные стекла в то время были совершенно неизвестны. Вставленная в сделанную Левенгуком же оправу, эта лупа требовала известного навыка в обращении. Линзочки, т. е. увеличительные стекла Левенгука, были очень малы — величиной с крупную горошину. Пользоваться ими было трудно. Крохотное стеклышко в оправе на длинной ручке приходилось прикладывать вплотную к глазу. Но, несмотря на это, наблюдения Левенгука отличались для того времени большой точностью. Эти замечательные линзы и оказались окном в новый мир.
Долгое время считалось, что Левенгук изготавливал свои линзы путём филигранной шлифовки, что, учитывая их крошечные размеры, было необычайно трудоёмким занятием, требовавшим огромной точности. После Левенгука никому не удавалось изготовить аналогичные по устройству приборы такого же качества изображения.
Однако в конце 1970-х годов в Новосибирском медицинском институте был опробован метод изготовления линз не шлифовкой, а оплавлением тонкой стеклянной нити. Такой метод позволил изготавливать линзы и даже полностью воссоздать микроскоп системы Левенгука, хотя экспертиза его оригинальных микроскопов XVII века с целью подтвердить или опровергнуть эту гипотезу так и не была проведена. Линзы изготавливались методом оплавления конца стеклянной нити до образования стеклянного шарика с последующей шлифовкой и полировкой одной из его сторон (плоско-выпуклая линза). Получающийся стеклянный шарик прекрасно работает как собирательная линза. Таким образом, имеется две версии изготовления линз Левенгуком — с использованием метода термической шлифовки (стеклянный шарик) или путём дополнительной шлифовки и полировки одной из его сторон обычным способом после термической обработки.
Усовершенствованием своих микроскопов Левенгук занимался всю жизнь: он менял линзы, изобретал какие-то приспособления, варьировал условия опыта. После его смерти в рабочем кабинете, который он называл музеем, насчитали 273 микроскопа и 172 линзы.
С помощью этих линз мастер обнаружил удивительные вещи. Пытаясь найти причину острого вкуса перца, Левенгук решил рассмотреть под своим микроскопом каплю перечного настоя. И, к собственному удивлению, увидел, что настой двухнедельной давности кишит крохотными организмами, которые наблюдатель назвал «анимакули». Так Левенгук стал первым человеком, увидевшим микробов.
В 1673 году друг изобретателя, знаменитый голландский врач Р. Грааф, направил в Лондонское королевское общество (самый авторитетный научный центр того времени) письмо Левенгука с первым сообщением о его изобретении и открытии. Эта переписка поддерживалась Левенгуком на протяжении 50 последующих лет. Писал он и знаменитым учёным: X. Гюйгенсу, Р. Гуку, Г. Лейбницу, Р. Бойлю и др. В его письмах содержались сообщения о поразительных открытиях: анимакули обнаружились везде — в гнилой воде канав, в почве и даже… в соскрёбе с зубов. В 1673 году Антони ван Левенгук первым из людей увидел микробов. Каково же было его изумление, когда в зубном налете, в капле воды и многих других жидкостях он увидел несметное множество живых существ. Они имели вид и палочек, и спиралей, и шариков. Иногда эти существа обладали причудливыми отростками или ресничками. Многие из них быстро двигались.
Вот что писал Левенгук в английское Королевское общество о своих наблюдениях за анимакулями: «Некоторые из них в длину были раза в три-четыре больше, чем в ширину, хотя они и не были толще волосков, покрывающих тело вши. Другие имели правильную овальную форму. Был там ещё и третий тип организмов наиболее многочисленный, — мельчайшие существа с хвостиками». Так совершалось одно из великих открытий, положившее начало микробиологии — науке о микроскопических организмах.