В 1940 году заводу № 18, находившемуся в Воронеже, выдали заказ на 70 самолетов с моторами М-105. Ер-2 стали покидать сборочный цех в 1941 году. В апреле сдали первые семь бомбардировщиков, в мае — десять. В июле производство бомбардировщиков завершилось выпуском 71-й машины. Устранение дефектов и учет замечаний заказчика на серийных Ер-2 привели к незначительному их отличию от прототипа. В частности, изменились выхлопные патрубки моторов и установка антенны связной радиостанции, расширили люк в кабине штурмана. Видимо, уже во время войны турельный пулемет БТ заменили на ШКАС, а экипаж сократили до трех человек. Пришлось устранять причины падения давления бензина, вызывавшего перебои в работе моторов из-за подсоса в топливную систему воздуха из пустых крыльевых баков и дефекты шасси. Были и другие, но более мелкие доработки.
Ослабленное оборонительное вооружение быстро дало о себе знать, и вскоре его усилили, вернувшись к первоначальной схеме. Летные характеристики серийных самолетов практически не изменились. Исключением стала максимальная скорость, снизившаяся до 430 км/ч из-за неубирающейся верхней стрелковой установки.
Первые самолеты стали поступать в 420-й дальнебомбардировочный авиаполк (дбап) под командованием Н.И. Новодранова, формировавшийся в Воронеже и вошедший в состав 81-й авиадивизии. Полк комплектовался в основном летно-техническим составом из 100-го дбап и ГВФ. Переучивание личного состава полка началось 24 июня, а спустя месяц потеряли первый бомбардировщик. 24 июля 1941 года при выполнении сдаточного полета на заводе № 18 в районе аэродрома Россошь самолет Ер-2 (заводской № 705) был дважды атакован и обстрелян истребителем И-16. Особенно бросалось в глаза двухкилевое оперение, присущее немецкому двухмоторному истребителю Ме-110. После второй атаки самолет загорелся. Летчик-испытатель Воронежского авиационного завода майор К.К. Рыков и ведущий инженер НИИ ВВС военинженер 2 ранга Н.М. Кокорин прыгнули с парашютами. Бортрадист Сафонов и борттехник Серегин погибли.
Как вспоминал дважды Герой Советского Союза летчик А.И. Молодчий,
Самыми загадочными оставались пожары на двигателях. Устранить опасное явление помог механик, самовольно проникший на борт и наблюдавший за всем происходящим в полете. Причина заключалась в неудачном расположении дренажных трубок карбюраторов. Как рассказывал Молодчий, стоило лишь удлинить эти трубки, выведя их за пределы капотов, и пары бензина перестали скапливаться в подкапотном пространстве, исключив тем самым пожары.
10 августа, когда 28 Ер-2 перелетели из Воронежа на аэродром города Пушкина под Ленинградом, начался отсчет боевых будней. Вечером этого же дня вслед за бомбардировщиками ТБ-7 стали отправляться на Берлин и Ер-2. Первые перегруженные машины поднимали с грунтовой взлетно-посадочной полосы (по приказанию будущего главкома ВВС П.Ф. Жигарева) опытные пилоты: заместитель командира 420-го авиаполка А.Г. Степанов, заместитель командира эскадрильи лейтенант В.М. Малинин и командир звена лейтенант Б.А. Кубышко. Четвертым рулил младший по званию и опыту летчик А.Г. Молодчий. Самолет оторвался от земли на самом краю аэродрома, и, как вспоминал Александр Игнатьевич, преждевременно увеличенный взлетный угол привел к потере скорости. Бомбардировщик, коснувшись земли, угодил колесами в дренажную канаву… После этого старт оставшихся Ер-2 прекратили.
Капитан А.А. Баленко (слева) у Ер-2, 421 бап