С июля 1941 г. на отдельных машинах монтировались самодельные пулеметные установки. С августа начато оснащение самолетов ВВС и ГВФ 1 — 3x7,62. На заводе № 84 введена установка верхней турели с августа, бортовых и носового пулемета — с сентября. С апреля 1942 г. появились опытные установки под 12,7-мм пулеметы. С сентября того же года на заводе монтировалось вооружение 1x12,7+3x7,62. Одновременно приступили к перевооружению аналогичным образом самолетов более раннего выпуска. Непосредственно в частях устанавливались 3 — 4x7,62, 1x12,7+1x20 и т. д.
С начала 1942 г. на фронте на ПС-84 начали монтировать бомбодержатели. С мая 1942 г. штатное бомбовое вооружение устанавливалось прямо на заводе, одновременно различными предприятиями аналогично дорабатывались самолеты предыдущих серий. Бомбовая нагрузка до 1000 кг.
В годы Второй мировой войны Ли-2 использовались советскими ВВС и морской авиацией, а также с августа 1944 г. — ВВС Польши.
В годы войны серийно выпускались модификации:
— ПС-84 пассажирский на 13–21 место, экипаж — 5 чел. (в военное время — 4 чел.), строился до июля 1941 г., с конца 1940 г. комплектовался храповиками под автостартеры, зимними лобовыми капотами, оборудование, винты и колеса отечественные (ранее — американские), с августа 1941 г. устанавливалось стрелковое вооружение 1 — 3x7,62;
— ПС-84 военно-транспортный, строился с июля 1941 г., экипаж — 4 чел., имел упрощенное оборудование салона, без кресел, усиленный пол, с августа — грузовую дверь на левом борту, бронеспинки пилотских кресел, вооружение 4x7,62, с октября 1941 г. часть самолетов комплектовалась для санитарных перевозок на 18 лежачих, 2 сидячих раненых и одного санитара, с марта 1942 г. двери, внутренние перегородки и некоторые другие узлы изготовлялись из дерева;
— ПС-84 (с сентября 1942 г. — Ли-2) многоцелевой (транспортный и ночной бомбардировщик), выпускался с июня 1942 г., имел дополнительные бензобаки, систему наддува основных баков отработанными выхлопными газами, усиленное шасси, антиобледенительную систему, экипаж- 4 чел., вооружение 4x7,62, с сентября- 1x12,7+3x7,62, бомбы до 1000 кг;
— Ли-2НБ, ночной бомбардировщик с вооружением 1x12,7+2x7,62, бомбы до 1000 кг, застекленная выпуклая дверь слева, экипаж — 6 чел.;
— Ли-2Т, военно-транспортный самолет без вооружения и системы отопления, в салоне — откидные фанерные лавки, экипаж — 4 чел., выпускался с мая 1945 г.;
Первый построенный ПС-84 использовали как санитарный в «зимней» войне с Финляндией. К началу Великой Отечественной машины этого типа имелись в гражданской авиации, бригаде особого назначения ВВС, морской авиации и авиации НКВД. Пассажирские ПС-84 после нападения Германии были сосредоточены в авиагруппах ГВФ, приданных фронтам и флотам, в основном в Особой Московской авиагруппе (ОМАГ). С первых дней войны они обеспечивали перевозки людей и грузов в интересах вооруженных сил. В октябре 1941 г. участвовали в срочной переброске в район Орла частей 5-го воздушно-десантного корпуса. В том же месяце снабжали по воздуху гарнизон о. Даго.
С начала октября 1941 г. был организован знаменитый «воздушный мост» в Ленинград. В январе — феврале 1942 г., в ходе контрнаступления под Москвой, ПС-84 привлекались к выброске воздушных десантов, в частности, под Вязьмой. Позже они сбрасывали грузы десантникам и конно-механизированным группам, прорвавшимся в тыл противника.
Как бомбардировщики ПС-84 впервые использовали в Карелии в марте 1942 г. Это были кустарно переделанные машины. Первой же операцией «настоящих» бомбардировщиков стал налет на Щигры 24 июня 1942 г. Ли-2 с бомбами активно использовали в боях на Дону и под Сталинградом. Их количество в АДД постоянно возрастало. В феврале 1944 г. они участвовали в массированных ночных налетах на города Финляндии, в сентябре того же года бомбили Венгрию, в декабре — Восточную Пруссию. Последний случай применения Ли-2 в больших количествах в качестве бомбардировщиков — удары по Кенигсбергу в апреле 1945 г., при этом часть вылетов совершалась днем.
Всю войну с Ли-2 выбрасывались разведывательные и диверсионные группы в тылу врага. С сентября 1942 г. самолеты начали летать к партизанам, а со следующего года эта практика приобрела массовый характер.