Тоща папа, несмотря на свою злопамятность, решил вступить в сделку с Карлом V, чтобы воспользоваться императорской помощью и наказать Флоренцию, о ставшуюся верной своему союзу с Францией. Знаменосец Каппони, поддерживавший переписку со святым отцом, был низложен в апреле 1529 года и заменен Франческо Кардуччи — непримиримым предводителем народной партии. Теперь ничто, кроме содержания Екатерины под стражей, не могло помешать Клименту VII отомстить флорентийцам.
Дипломатическая изоляция Флоренции стала возможна благодаря тайному Барселонскому трактату, заключенному в июне 1529 года между папой и императором, а потом — Камбрейскому договору, который пятого августа 1529 года закрепил отказ Франции от своих итальянских союзников. После этого Карл V как победитель смог направиться в Италию, отданную ему папой. Высадившись в Генуе в конце августа, он вступил в Милан, чтобы восстановить власть Франческо Сфорца и продиктовать свои условия Венеции и Ферраре, вынужденным вернуть Святому престолу земли, захваченные в 1527 году. А Флоренция должна была быть уничтожена силой в соответствии с обещанием, данным папе. Поэтому императорская армия под командованием принца Оранского в конце сентября получила приказ идти на столицу Тосканы. К ней быстро присоединилось папское войско. В октябре город был осажден со всех сторон.
Уже два года Екатерина жила в бушующей Флоренции, запертая то в одной, то в другой обителях. В декабре 1527 года она перешла из монастыря Святой Лючии в монастырь Святой Екатерины Сиенской; но там началась эпидемия заразной болезни, и посол Франции де Велли смог с согласия Синьории забрать ее оттуда декабрьским вечером 1527 года и перевезти в бенедиктинский монастырь Мурате, или Замурованных. В этом аббатстве со строгим монастырским укладом жизни юную Екатерину Медичи ожидал присмотр, больше похожий на заточение. В то же время, благодаря толстым стенам, это было убежище более надежное, чем дворец. Новая жизнь Екатерины не была особенно мрачной. С давних пор знатные дамы выбирали эту обитель для своего уединения. Екатерина занимала там просторную келью, построенную в начале века для Катарины Сфорца Риарио, вдовы одного из Медичи, матери кондотьера Джованни делла Банде Нере. Ей прислуживали две женщины, но недоставало любви ее близких: Кларисса Строцци, ее тетка, к тому времени уже умерла.
Многие монахини принадлежали к крупной флорентийской знати. Во время осады они продемонстрировали свою привязанность к Медичи, посылая сторонникам семьи, оказавшимся в плену, сладости и корзинки с фруктами, украшенные шестью геральдическими шарами этой династии.
В монастыре, куда не доносилась пушечная канонада, почти ничто не нарушало установленного уклада жизни, заполненной простыми удовольствиями. «Матушки хорошо встретили и баловали эту хорошенькую восьмилетнюю девочку с очень изящными манерами, вызывавшую всеобщую любовь». Она была «такая мягкая и приветливая, что матушки очень сочувствовали се горестям и неприятностям». Она с удовольствием слушала великолепное пение монахинь во время служб, на которые верующие стекались со всей Флоренции в церковь, открытую для внешнего мира.
Екатерине было десять лет, когда началась памятная осада Флоренции, которой суждено было продлиться с октября 1529 по август 1530 года. Флорентийцы безжалостно расчистили вокруг города пространство шириной в одну милю. Они сожгли прекрасные виллы и испортили отличные угодья, чтобы врагу было негде спрятаться.
Осада была особенно тяжела для флорентийцев, потому что в городе свирепствовала чума. У кого была такая возможность, бежали в безопасные места. Напротив, Микеланджело вернулся в город из Феррары, куца его посылала Синьория для ознакомления со знаменитыми феррарскими крепостными сооружениями и консультаций с известными знатоками фортификационного искусства. Вооруженный новыми знаниями, он пришел к выводу, что холм Сан-Мипьято — самое важное место во всей обороне города, и приказал его укрепить фортификационными сооружениями. Здесь, защищая колокольню от разрушения, он вывесил вокруг нее на канатах матрацы, туго набитые шерстью, и этим действительно спас замечательный памятник искусства.
Синьорией были объявлены суровые постановления: чтобы добыть необходимые деньги для ведения войны, потребовались новые экстренные налоги; было отобрано и распродано имущество госпиталей и монастырей; было приказано сдать на монетный двор все имеющиеся у граждан золотые и серебряные предметы; устраивались лотереи, в которых разыгрывались вещи эмигрантов. Но усилия осажденных были сведены на нет слабостью кондотьера Эрколе д'Эсте и предательством правительства Бальони.
Чума и голод только разжигали ненависть «бешеных» по отношению к Медичи; они сожгли виллу Кареджи, распространяли неприличные карикатуры и позорящие папу куплеты.
Еще в начале осады один из республиканцев посоветовал Синьории забрать Екатерину из монастыря и поместить ее в дом терпимости, чтобы навсегда замарать ее имя и лишить Климента VII надежды выдать ее когда-нибудь замуж за знатного вельможу.