Расположенный далеко от Москвы, обнесенный прочными стенами, Кириллов монастырь становится также местом ссылки противников Ивана Грозного. Число их особенно увеличивается в 30-40-е годы XVI века, в период боярского правления. Из сосланных в монастыре находят пристанище князья Воротынские, в том числе герой Казанского похода воевода Владимир Иванович Воротынский, московский митрополит Иоасаф, касимовский хан Симеон Бейбулатович, объявленный Грозным во время опричнины «царем московским», и другие.
На средства таких «ссыльных» и иных богатых и родовитых иноков в монастыре возводится ряд сооружений, в том числе церковь-усыпальница во имя Владимира на могиле В. И. Воротынского. Постройка этой церкви вызвала бурный протест Ивана Грозного, проявлявшего особый интерес к монастырю и противившегося всякому возвеличению в нем боярства. Его резкое по тону и злое послание игумену с братией дышит негодованием: «А вы се над Воротыньским церковь есте поставили! Оно над Воротыньским церковь, а над чюдотворцом нет. Воротыньский в церкви, а чюдотворец за церковию!»
Во второй половине XVI века сооружается четыре новых каменных храма: церковь над гробом Кирилла (фактически придел, пристроенный к Успенскому собору), на отсутствие которой в свое время сетовал Иван Грозный, трапезный храм Сергия Радонежского в Ивановском монастыре, церковь Иоанна Лествичника с приделом Федора Стратилата на Святых воротах и храм Преображения над воротами, «что к Сиверскому озеру», который также включал два придела — Ирины и Николая. После них вплоть до второй четверти XVII века новых храмов в монастыре не возводили.
Кирилло-Белозерский монастырь того времени является не только средоточием духовной и культурной жизни Белозерского края, но и крупнейшим землевладельцем, хозяйственным и ремесленным центром. Изделия его находили сбыт на огромной территории всего Московского государства. В самом монастыре и за его оградой возникают различные хозяйственные сооружения: мельницы, сушила,
житницы, конюшни, кузницы, кожевни. В описаниях 1581 года упоминаются солодожня, гостиный двор, кузнечная изба и гостиная келья — помещение для приезжих. Кроме того, на обитель работает целый ряд деревень, расположенных в ее округе, получая годовой оброк или «задельную» плату.