В стенах собора похоронены все цари, от Петра I до Александра III (только Петр II, умерший в Москве, там и был похоронен, да нет Иоанна VI Антоновича).
Обычай хоронить членов царской династии в храмах, основывавшийся на древнейшем представлении о божественном происхождении их власти, был широко распространен во всем христианском мире. В допетровской Руси таким храмом был Архангельский собор Московского Кремля. С переносом в 1712 г. столицы из Москвы в Петербург его значение перешло к Петропавловскому собору. По этому поводу один из первых историков собора писал: «Архангельский собор в Москве весьма справедливо называют святилищем истории Российской, как заключающий в себе останки наших великих князей от Калиты… до царя Иоанна Алексеевича. Это название, столь же справедливо, принадлежит собору Петропавловскому — как служащему усыпальницей августейших особ нашего Императорского Дома со времен основания Санкт-Петербурга…».
Первой в церкви Апостолов Петра и Павла была похоронена полуторагодовалая дочь Петра I Екатерина, скончавшаяся в 1708 г. (Впоследствии деревянную церковь, построенную в 1703—1704 гг., разобрали в связи с начавшимся в 1712 г. строительством на этом месте каменного храма.) К моменту смерти Петра I собор еще не был достроен. Поэтому внутри него, по проекту Доменико Трезини, была сделана временная деревянная церковь. Туда 10 марта 1725 г., с подобающей пышной церемонией, перенесли тела Петра I и его дочери Натальи, скончавшейся 4 марта. Оба гроба были установлены на катафалке под балдахином, обитом золотой тканью. В 1727 г. там же поставили и гроб с телом его жены, императрицы Екатерины I. В мае 1731 г. императрица Анна Иоанновна повелела предать земле прах Петра I и его супруги. Погребение происходило с особенно учрежденной церемонией 29 мая в субботу, в одиннадцатом часу утра. При этом присутствовали вельможи и многие коллежские чины. Во время опускания гробов в крепости был произведен пятьдесят один выстрел. Точная дата предания земле праха его дочери неизвестна.
Захоронения производились в землю, и места могил отмечались вделанными в пол мраморными плитами с надписями и позолоченными крестами. В 1865 г. плиты заменили надгробиями. Среди них примечательны гробницы, воздвигнутые у северной стены собора над могилами Александра II и его жены. Оба саркофага высечены из цельных монолитов: первый — из алтайской яшмы (вес его около 4960 кг), второй — из уральского орлеца (вес около 6560 кг). Работу, которая длилась 17 лет и была закончена в 1906 г., выполняли мастера Петергофской гранильной фабрики. Справа от южного входа в собор установлена гробница на месте захоронения Петра I. Гроб с телом Петра был перенесен в еще недостроенный собор, в течение шести лет (1725—1731 гг.) стоял посреди собора и, наконец, был предан земле на месте, избранном самим Петром еще при его жизни.
В течение многих лет собор служил своеобразным музеем, где сосредоточивались почетные трофеи, взятые русскими войсками в ходе Северной войны со Швецией, войны с Турцией в конце XVIII в., Отечественной войны 1812 года и других войн. В настоящее время эти трофеи (знамена, ключи от взятых крепостей, оружие и т. п.) находятся в Историческом музее в Москве.
В непосредственной близости к Петропавловскому собору в начале XX в. по проекту архитекторов Д. Гримма, А. Томишко и Л. Бенуа было закончено строительство усыпальницы для захоронения великих князей. Это здание соединяется с Петропавловским собором. Рядом с куполом усыпальницы еще более высоким кажется золотой шпиль колокольни собора, который, поднимаясь над гладью Невы, как бы перекликается с Адмиралтейской иглой, куполом Исаакиевского собора и башней Кунсткамеры, являясь главным украшением прекрасного ансамбля невских набережных.
В 1998 г. в Екатерининском приделе собора Петропавловской крепости захоронены останки последней царской семьи. Правда, церковь не признает их «царскими», поэтому, видимо, молебен летом 2001 г. проходил не у главного алтаря, а в приделе.
Придел — пристройка к православному храму со стороны южного или северного фасада или специально выделенная часть основного здания с дополнительным алтарем для отдельных богослужений.
Сомнения церкви основаны на выводах следователя Н. Соколова, который еще в 1918 г. по горячим следам преступления пришел к заключению, что изуверы расчленили, а затем сожгли тела убитых.
Недавно японский ученый Тацуо Нагай провел собственное исследование капли пота Николая II, и заявил, что она не имеет ничего общего с захороненными костями. Помимо профессора питерцам было и другое знамение, что останки ненастоящие. В день годовщины захоронения — 17 июля — с крыши Смольного собора ураганом снесло крест. После чего по городу прокатилась молва, что это небесный знак, указующий на ошибку.