Призванный Сикстом IV в Рим, он написал в Сикстинской капелле картину «Христос, вызывающий Петра и Андрея из сетей», особенно прекрасную на фоне гор, моря и неба. Во время пребывания в Риме он изучал и рисовал арки, бани, колонны, акведуки и амфитеатры древнего города, причем с таким натренированным глазом, что мог сразу, без правил и компаса, уловить справедливые пропорции каждой детали. Флорентийский купец в Риме Франческо Торнабуони, оплакивая умершую жену, поручил Гирландайо написать фрески для ее мемориала в Санта-Мария-сопра-Минерва, и Доменико так преуспел, что Торнабуони отправил его обратно во Флоренцию, вооружив флоринами и письмом, свидетельствующим о его превосходстве. Вскоре синьоры доверили ему украшение Зала дель Оролоджио в своем дворце. В следующие четыре года (1481–5) он написал сцены из жизни святого Франциска в капелле Сассетти в Санта-Тринита. Весь прогресс живописного искусства, за исключением использования масла, воплотился в этих фресках: гармоничная композиция, точная линия, градации света, верность перспективы, реалистичный портрет (Лоренцо, Полициана, Пульчи, Палла Строцци, Франческо Сассетти) и в то же время анджелесская традиция идеальности и благочестия. От почти совершенного алтарного образа «Поклонение пастухов» — всего лишь шаг более глубокого воображения и тонкого изящества к Леонардо и Рафаэлю.
В 1485 году Джованни Торнабуони, глава банка Медичи в Риме, предложил Гирландайо двенадцать сотен дукатов (30 000 долларов) на роспись капеллы в Санта-Мария-Новелла и пообещал еще двести, если работа окажется полностью удовлетворительной. С помощью нескольких учеников, включая Микеланджело, Гирландайо посвятил этой кульминации своей карьеры большую часть последующих пяти лет. На потолке он написал четырех евангелистов; на стенах — святого Франциска, Петра Мученика, Иоанна Крестителя и сцены из жизни Марии и Христа, от Благовещения до великолепной Коронации Девы. Здесь он снова восхищался современными портретами: статная Лодовика Торнабуони, пригодная для роли королевы, дерзкая красавица Джиневра де Бенчи, ученые Фичино, Полициан и Ландино, художники Бальдовинетти, Майнарди и сам Гирландайо. Когда в 1490 году капелла была открыта для публики, все сановники и литераторы Флоренции собрались, чтобы осмотреть картины; реалистичные портреты стали предметом всеобщего обсуждения, а Торнабуони выразил свое полное удовлетворение. В то время он просил Доменико простить ему лишние двести дукатов; художник ответил, что удовлетворение его покровителя для него дороже любого золота.
Он отличался любвеобильностью, его так обожали братья, что один из них, Давид, чуть не зарубил аббата выдержанной буханкой хлеба за то, что тот приносил Доменико и его помощникам еду, которую Давид считал недостойной гения брата. Гирландайо открыл свою мастерскую для всех желающих работать или учиться в ней, превратив ее в настоящую школу искусств. Он принимал все заказы, большие и малые, заявляя, что ни в одном не должен отказывать; заботу о своем хозяйстве и финансах он оставил Давиду, сказав, что не будет доволен, пока не распишет весь контур стены Флоренции. Он создал множество посредственных картин, но и случайных произведений, обладающих большим очарованием, таких как восхитительный дедушка с луковичным носом в Лувре и прекрасный женский портрет в коллекции Моргана в Нью-Йорке — картины, полные характера, который год за годом отражается на человеческом лице. Великие критики с бесспорным образованием и репутацией отводят ему лишь незначительное место;30 И это правда, что он преуспел скорее в линии, чем в цвете, что он писал слишком быстро и перегружал свои картины несущественными деталями, и сделал шаг назад, возможно, предпочтя темперу после экспериментов Бальдовинетти с маслом. Тем не менее, он довел накопленную технологию своего искусства до высшей точки, которой оно могло достичь в его стране и в его веке; и он завещал Флоренции и всему миру такие сокровища, что критика в благодарности повесила голову.