Разбойница Дюбуа заставляет Жюстину вступить в банду, а когда та отказывается, отдает ее на поругание разбойникам. Каждодневно терпя моральные и физические мучения, Жюстина остается в шайке, но всеми силами пытается сохранить свою девственность. Однажды разбойники захватывают в плен некоего Сент-Флорента; Жюстина из человеколюбия помогает пленнику совершить побег и сама бежит вместе с ним. Но Сент-Флорент оказывается негодяем: он оглушает Жюстину, в бессознательном состоянии насилует ее и бросает в лесу на произвол судьбы.
Истерзанная Жюстина нечаянно становится свидетельницей противоестественной связи графа де Бриссака с его лакеем. Обнаружив девушку, граф сначала запугивает ее до полусмерти, но потом меняет гнев на милость и устраивает ее горничной к своей тетке. Несмотря на очаровательную внешность, в душе господина де Бриссака обитают всевозможные пороки. Стремясь внушить Жюстине принципы своей извращенной морали, он приказывает ей отравить тетушку. Перепуганная Жюстина рассказывает все госпоже де Бриссак. Старушка возмущена, а граф, поняв, что его предали, выманивает Жюстину из дома, срывает с нее одежды, травит собаками, а потом отпускает на все четыре стороны.
Кое-как Жюстина добирается до ближайшего городка, находит врача, и тот исцеляет ее раны. Так как у Жюстины кончаются деньги, она отваживается написать графу де Бриссаку, дабы тот вернул причитающееся ей жалованье. В ответ граф сообщает, что тетушка его скончалась от яда, отравительницей считают Жюстину и полиция разыскивает ее, так что в ее интересах скрыться где-нибудь в укромном месте и более его не беспокоить. Расстроенная Жюстина доверяется доктору Родену, и тот предлагает ей место служанки у себя в доме. Девушка соглашается.
Помимо врачевания Роден содержит школу, где совместно обучаются мальчики и девочки, все как на подбор очаровательные. Не в силах понять, в чем тут дело, Жюстина принимается расспрашивать дочь доктора Розалию, с которой она успела подружиться. С ужасом Жюстина узнает, что доктор предается разврату как с учениками, так и с собственной дочерью. Розалия отводит Жюстину в потайную комнату, откуда та наблюдает чудовищные оргии, устраиваемые Роденом с подвластными ему жертвами. Тем не менее Жюстина по просьбе Розалии остается в доме доктора и начинает наставлять подругу в христианской вере. Неожиданно Розалия исчезает. Подозревая ее отца в очередной чудовищной проделке, Жюстина обыскивает дом и находит свою подругу запертой в потайном чулане: Роден решил умертвить дочь, произведя над ней некую хирургическую операцию. Жюстина устраивает Розалии побег, но сама попадает в руки доктора; Роден ставит ей на спину клеймо и отпускает. Жюстина в ужасе — ей и так вынесен приговор, а теперь еще и клеймо… Она решает бежать на юг, подальше от столицы.
Жюстина выходит к монастырю, где хранится чудотворная статуя Святой Девы, и решает пойти помолиться. В обители ее встречает настоятель дон Северино. Благородная внешность и приятный голос настоятеля внушают доверие, и девушка чистосердечно рассказывает ему о своих злоключениях. Убедившись, что у Жюстины нет ни родных, ни друзей, монах меняет тон, грубо хватает ее и тащит в глубь монастыря: за фасадом святой обители скрывается гнездо разврата и порока. Четверо отшельников во главе с настоятелем залучают к себе девиц, чье исчезновение не влечет за собой никаких последствий, заставляют их участвовать в оргиях и предаваться самому разнузданному разврату, удовлетворяя извращенное сладострастие святой братии. В зависимости от возраста девушек делят на четыре разряда, у каждого разряда свой цвет одежд, свой распорядок дня, свои занятия, свои наставницы. Крайняя осторожность святых отцов и их высокое положение делают их неуязвимыми. Женщин, наскучивших монахам, отпускают на свободу, но, судя по некоторым намекам, свобода эта означает смерть. Бежать из обители невозможно — на окнах толстые решетки, вокруг рвы и несколько рядов колючей живой изгороди. Тем не менее истерзанная Жюстина, едва не испустившая дух под розгами развратников, решается бежать. Случайно найденным напильником она перепиливает оконную решетку, продирается сквозь колючие кусты, скатывается в ров, наполненный трупами, и в ужасе бежит в лес Там она опускается на колени и возносит хвалы Господу. Но тут двое незнакомцев хватают ее, накидывают на голову мешок и куда-то волокут.