Тревожило, их и то, что политика России в Приамурье привлекала местное население. Большинство князьцов соглашалось платить ясак. «За ясаком де дело не станет, было бы постоянство», — часто приходилось слышать Хабарову и его товарищам. Эвенкийские и даурские вожди Гантимур, Туйдухонь, Бойгонь приняли российское подданство, подавая этим самым пример другим племенам и народам, населявшим не только левобережный, но и правобережный Амур. Маньчжуры понимали, что принятие в российское подданство народов Приамурья навсегда положит конец их набегам в этом регионе, грабежу, безнаказанному захвату и угону пленных.
Маньчжуры начали захват Внутреннего Китая в 1644 г. Эта акция могла и провалиться. В таком случае единственным тылом для династии Цин стала бы территория собственно Маньчжурии, где можно было бы укрепиться, отсидеться и собраться с новыми силами для продолжения захватнических войн. Но территория Маньчжурии в условиях войны с китайским народом, с точки зрения цинов, была уже мала. Тыл нужно было расширить за счет более отдаленных от Китая территорий. И такой территорией было Приамурье.
Маньчжурское войско вышло из Нингуты. Отныне этот город, как отмечает Г. В. Мелихов, стал играть для маньчжуров роль «ключевого пункта на переднем крае борьбы против русской колонизации Амура». В войске было более 2 тыс. человек. Почти половину из них составляли «сведенцы» — даурские и тунгусские люди, еще ранее насильственно угнанные в Маньчжурию.
Так как на каждого из двух всадников приходилось по 3 лошади, путь от Нингуты до Ачанского острога войско преодолело, почти нигде не останавливаясь, за 3 месяца. Общее командование осуществлял фудутун (военный наместник) Хайсэ. Его помощником был Сифу, которого русские источники называют Исинеем.
Вооружение войска состояло из холодного и огнестрельного оружия: сабель, пик, куяков, 6 пушек, 30 пищалей, 12 петард. Последние представляли собой глиняные сосуды, набитые порохом. В каждую из петард было положено по пуду пороха. Их подкладывали под городские стены и башни и взрывали.
Замысел маньчжуров состоял в том, чтобы внезапным ударом отрезать казаков, которые находились в избах вне городских стен, уничтожить их, а затем расправиться или взять в плен защитников города. 24 марта на утренней заре маньчжурам удалось бесшумно приблизиться к Ачанскому острожку и окружить его. Первым увидел врагов казачий есаул Андрей Иванов, который поднял тревогу, закричав: «Братцы казаки! Ставайте наскоре и оболокайтесь в куяки крепкие!» В этот момент, по словам Хабарова, «сверх Амура-реки славные ударила сила и ис прикрыта на город на Ачанской, на нас, казаков, сила богдойская, все люди конные и куячные!» Особенно тяжело пришлось тем полчанам, которые находились в избах за пределами городка. Чтобы не очутиться в руках неприятеля, им нужно было в считанные секунды попасть в город под прикрытие его стен. Ворота для них открывать уже было поздно. Оставался один путь: перебираться туда через стену. «И метались казаки в город, в единых рубашках, на стену городовую», — писал об этом трагическом моменте Хабаров. Одновременно маньчжуры открыли огонь по городку из пушек и из пищалей. Однако когда первые секунды замешательства прошли, казаки открыли ответный огонь из пушек и из ружей и не дали врагу подойти близко. Окрестности огласились страшной канонадой: «И мы, казаки, чаяли, ис пушек, из оружья бьют казаки из города, ажно бьет из оружия и из пушек по нашему городу казачью войско богдойское». Бой продолжался «с зари до схода солнца».
К концу дня перевес стал клониться в сторону маньчжуров. Им наконец удалось подойти близко к стенам, занять пустые казачьи дома, с их крыш начать прицельный обстрел и тем самым на мгновенье сковать действия защитников внутри городка. Этих секунд было достаточно. Маньчжуры прорвались через линию огня к одному из участков стены. Здесь они повесили на стену свои знамена («знаменами стену городовую укрывали») как призыв к штурму. Однако стену взять не удалось: казаки крепко держали круговую оборону. Тогда маньчжуры «вырубили три звена стены сверху до земли». Исиней отдал приказ «всему войску богдойскому», который в пересказе Хабарова звучал примерно так: «Не жгите и не рубите казаков, емлите их, казаков, живьем!» Его слова были переведены. Исиней предлагал казакам сдаться с оружием в руках. Но не такими были казаки. Многие из них, предпочитая позорному плену смерть, стали между собой прощаться. Используя минутную передышку, наступившую в штурме, ободряя своих товарищей, Ерофей Павлович обратился к ним: «Умрем мы, братцы казаки, за веру крещеную, и постоим за Дом Спаса и пречистыя и Николы Чудотворца, и порадеем мы, казаки, государю царю и великому князю Алексею Михайловичу всеа Руссии и помрем мы, казаки, все за один человек против государева недруга, а живы мы, казаки, в руки им, богдойским людям, мы, казаки, не дадимся!»