Проработав два года в Германии, она вернулась в Лондон, где открылась Больница комиссии частных благотворителей. Флоренс, полная энтузиазма и искреннего желания помочь людям, столкнулась с безразличием со стороны руководства больницей, которое на первое место ставило прибыль и престиж, а здоровью пациентов мало уделяло внимания.
В марте 1854 г. Англия и Франция вступили в войну с Россией. Близкий знакомый семьи Найтингейл, Сидней Герберт, занимавший в то время пост секретаря по военным делам, официально предложил Флоренс организовать отряд сестер милосердия для отправки на место боевых действий. Она с увлечением принялась за работу и, за короткий срок собрав отряд из 38 монахинь и сестер милосердия, отбыла в Скутари (Турция). Картина, представшая перед глазами Флоренс, была ужасающей: госпиталь представлял собой несколько полуразрушенных бараков, грязных и запущенных, где не было ни белья, ни предметов по уходу за больными, ни надлежащей врачебной помощи. Найтингейл вместе с другими сестрами принялась за титанический труд: они чистили бараки, организовывали горячее питание, ухаживали за больными. Флоренс писала в Лондон гневные письма, в которых рассказывала о катастрофической обстановке в госпиталях, позорной для Англии, о высокой смертности среди раненых, безжалостно клеймила организаторов военно-санитарного дела, боявшихся личной ответственности и не знавших, что следует делать. «Это не джентльмены, не воспитанные, не деловые, не люди чувства», – говорила она о них. Сама же Найтингейл проявляла «стальную выносливость», настойчивость и невиданную работоспособность, природное умение увлечь за собой людей. Среди ее медсестер не было ни одной, которая бы боялась трудностей, а Флоренс называла себя «главной хозяйкой» по уходу за больными и «прислугой для любой (грязной) работы». По воспоминаниям современников, «она каждую ночь обходила бараки, не боясь никакой заразы». Ее называли «Женщина с фонарем, несущая свет и добро».
Из конфликта с военным начальством Флоренс вышла победительницей. О ее деятельности быстро узнали в Лондоне. Был собран специальный фонд в 50 тыс. фунтов стерлингов, который поступил в ее полное распоряжение. Благодаря этому она сумела организовать достойный уход за больными, основанный на принципах санитарии. В результате этого смертность в лазаретах снизилась с 42 % до 2,2 %.
За два года упорной работы Флоренс добилась колоссальных успехов и завоевала заслуженную любовь и уважение соотечественников. Ее именем называли новорожденных девочек, ее портреты выставлялись в витринах магазинов. Возвращение Найтингейл в Англию было ознаменовано торжественным митингом и приемом.
В 1865 г. Найтингейл поручили реорганизовать армейскую медицинскую службу. Правительство выделило средства на проведение в жизнь необходимых реформ, поэтому Флоренс могла в корне изменить ситуацию в госпиталях. И хотя ей часто приходилось сталкиваться с непониманием со стороны консервативно настроенного начальства, она все же добилась, чтобы больницы были оснащены системами вентиляции и канализации, велась более четкая статистика заболеваний, а персонал в обязательном порядке проходил специальную подготовку. Один из журналов того времени писал: «Мисс Найтингейл показала, какой должна быть и была медицинская сестра: строгая и милосердная, смелая и сдержанная перед лицом страдания, одинаково внимательная к больным различных классов общества…»
В 1869 г. Найтингейл организовала школу для обучения медицинских сестер при Лондонской больнице Св. Фомы. Воспитанницы ее получали основательную научную подготовку. Флоренс подчеркивала, что «по своей сути сестринское дело как профессия отличается от врачебной деятельности и требует специальных знаний», что «дело управления больницами должны взять на себя специально обученные сестры». В это время по настоянию Найтингейл в армии велась разъяснительная работа о важности профилактики болезней.