Тяжелое было время, в которое Господь судил ему управлять паствою Тверскою. Начались тогда для России тяжкие испытания — царь Иоанн Грозный, мудро и благочестиво правивший Россией, стал ужасом и бичом для своих подданных, насаждая так называемую «опричнину». Тверь не принадлежала опричнине и потому не пользовалась благосклонностью царя. С ужасом и негодованием видел святитель Варсонофий, как его друг Герман, архиепископ Казанский (память 6/19 ноября), некогда пользовавшийся уважением царя, был вызван из Казани в Москву для возведения в сан митрополита, однако после того, как напомнил царю тихими и кроткими словами, что тот даст ответ на суде Божием за свои жестокости, был изгнан и умер в заточении. Много страшных событий прошло перед очами святителя Варсонофия за четыре года его архиерейского служения. Глубоко сокрушался о своей пастве святитель Варсонофий. Ощущая старческую немощь, он в 1571 году удалился на покой в основанную им в Казани обитель. Пять лет провел он в Преображенском монастыре на покое, в молитве и уединении, где принял великую схиму. Когда он не мог по немощи сам ходить в церковь, любящие ученики помогали ему посещать храм Божий, зная его любовь к богослужению. Скончался святитель Варсонофий 11 апреля 1576 года и был погребен в Преображенском монастыре архиепископом Казанским Тихоном. В 1595 году по благословению святейшего патриарха Иова (1588-1607) построен в этом монастыре новый храм в честь Преображения Господня. При строительстве храма были обретены мощи святителей Казанских Гурия и Варсонофия. Описание открытия мощей было сделано очевидцем, святителем Ермогеном (будущим патриархом), в то время Казанским архиепископом: «Когда же, 4 октября, дошли до гробов святых отцов, то пришли сказать об этом мне, смиренному. Принесши со всем освященным собором бескровную жертву Господу Богу и отпев панихиду, мы отправились в монастырь и, пришед на место, поклонились гробам преподобных отец Гурия и Варсонофия. Вскрыв гроб, мы увидали нечто совсем неожиданное: рака святого была полна благоуханного мира, мощи же святого Гурия носились, как губка, поверх мира; ни одна часть не была погружена. Нетлением одарил Бог честное и многотрудное тело его, как это видят все и ныне… Я, недостойный, многогрешною рукою коснулся святого тела, осязал ризы, в которых он был погребен, и они были весьма крепки. Попытался с силою потянуть и мантию его, и прочие погребальные одежды, и они казались крепче новых. В главах у преподобного Гурия лежал греческий клобук вязаный, который, по сказанию учеников святого Варсонофия, был сделан преподобным Варсонофием для Гурия и по смерти святителя положен недоконченным в возглавие гроба его. Мы соборне осмотрели этот клобук и, взяв прядь из него, едва могли перервать ее, потому что она была крепче новой. Мы перелили благоуханное миро в новый сосуд, и православные христиане, пользуясь тем миром, непрестанно получали исцеления. Потом мы открыли раку Варсонофия и увидали, что и его мощи почтены от Бога нетлением… в чем мы удостоверились, перелагая святые и чудотворные мощи обоих своими собственными руками с архимандритом Арсением из гробов в ковчеги. Дивясь неизреченному человеколюбию Божию, мы со слезами и кротостью пропели надгробные песни над преподобными отцами и поставили их поверх земли, дабы все приходящие видели их и, дивясь, славили Бога».
В «Иконописном подлиннике» дано описание образа святителя Варсонофия: «Подобием надсед, борода, как Гуриева (а борода святителя Гурия — как Василия Кесарийского), на конец раздвоилася, риза святительская, омофор и Евангелие». Жизнеописание святителей Гурия и Варсонофия составлено было священномучеником патриархом Ермогеном. Существует акафист святителю Варсонофию.
Возвестителю пути спасительнаго, истинный хранителю апостольских преданий, столпе непоколебимый, благочестия учителю и Православия наставниче, святителю Варсонофие, Владыку всех моли мир вселенней даровати и душам нашим велию милость.
Тихостию нрава направляемый, святителю Варсонофие, в тихое пристанище достигл еси, смиренномудрия ради удобно избежав сопротивных сетей, святою душею твоею на Небеса возлетел еси, идеже Христу предстоя, моли спастися нам, почитающим память твою.
По Божием законе ревнителю, лютый разрушителю неприязненныя лести, яко миром, потом своим во трудех и бдениих подвизася посреде Казанскаго царствия, обитель строя Боголепнаго Преображения и великому своему учителю Гурию последуя, с нимже великий союз имея духовный, якоже в животе, такоже и по преставлении: обретением честных мощей ваших во едино время и многими чудесы вас Бог прослави; и, радостию восходя в Небесныя обители, твердый камене веры, от иноплеменник многи скорби претерпел еси, добрый вводниче в вечную жизнь, в нюже, молим тя, введи ны, преподобне отче наш Варсонофие, и моли Христа Бога спастися душам нашим.