Жизнь замечательных устройств

Получение информации о трёхмерной структуре частиц, не обладающей спиралевидной симметрией, требует комбинирования данных от нескольких двумерных проекций этих частиц. В 1970 году Клуг совместно с ДеРозье и Энтони Краутером разработал подход, получивший название подхода общих линий, с помощью которого была определена трехмерная структура икосаэдрических конвертов вирусов (Proc. R. Soc. London., 1970, A 317, 319–340; DOI: 10.1098/rspa.1970.0119). В работе предполагалось, что аналогичный метод можно применить к частицам, не обладающим симметрией, но более эффективные результаты он даёт при анализе симметричных образцов.

Ещё одним шагом к применению электронной микроскопии в биохимии была разработка способов, позволяющих сохранить гидратированное состояние биомолекулы в камере электронного микроскопа, а также определить условия, в которых излучение прибора не разрушало бы анализируемый объект. Для этого Дональд Парсонс разработал конструкции камер электронного микроскопа, в которых поддерживалась влажность и комнатная температура (Science, 1974 186, 407–414; DOI: 10.1126/science.186.4162.407). Эти камеры позволили ему использовать электронную микроскопию для изучения кристаллов фермента-каталазы и найти условия, в которых облучение электронами не оказывает влияние на строение белка.

Также в 1970-е Роберту Глэйзеру удалось количественно оценить степень повреждения кристаллической каталазы и низкомолекулярных органических соединений в результате облучения потоком электронов (J. Ultrastruct. Res., 1971, 36, 466–482; DOI: 10.1016/S0022-5320(71)80118-1). Он же пришёл к выводу о том, что применение для анализа небольших доз электронов будет приводить к необходимости использования большого количества анализируемых объектов, что может увеличить соотношение сигнал-шум. Другими словами, изучение с помощью электронной микроскопии большого количества частиц приведет к тому, что та энергия излучения, которая могла бы повредить небольшое количество изучаемых объектов, будет просто равномерно распределена между большим количеством биомолекул одного и того же типа (J. Mol. Biol., 1975, 94, 425–432; DOI: 10.1016/0022-2836(75)90212-0). Охлаждение объекта исследования считалось ещё одним способом, который одновременно может понизить скорость испарения воды и защитить биологический материал от повреждения электронным пучком. В 1950-60-х годах Умберто Моран изучал возможности заморозки образцов и приготовления чрезвычайно тонких препаратов для их изучения с помощью криоэлектронной микроскопии (Annals of the New York Academy of Sciences, 1960, 85, 689–713; DOI: 10.1111/j.1749–6632.1960.tb49990.x). Однако при охлаждении вода обычно замерзает с образованием мельчайших кристалликов льда, на которых происходит дифракция электронов, в значительной степени искажающая сигналы, полученные при изучении образца, не говоря уже про то, что кристаллики льда могли изменить строение изучаемого объекта. О проблемах, связанных с образованием кристалликов льда при охлаждении клеток было известно ещё с 1940-х годов. Пытавшийся подбирать способы безопасного охлаждения Базиль Люе предлагал снизить негативное влияние холода на биологические образцы за счет ускорения процесса заморозки: быстрая заморозка способствует тому, что при этом вода затвердевает, формируя не кристаллическую, а аморфную твёрдую структуру. В 1960-е годы быстрая заморозка в первую очередь была применена для изучения белков с помощью рентгеноструктурного анализа. Помимо ударной заморозки образованию кристалликов льда препятствовало введение в образец антифризов — сахарозы или глицерина (Acta Crystallogr B, 1970, 26, 998-1004; DOI: 10.1107/S0567740870003485).