Размышления Леонардо о пространстве, линейной перспективе и о способах выражении разнообразных эмоций в живописи вылились в создание фрески, написанной в экспериментальной технике на дальней торцовой стене трапезной монастыря Санта-Мария делле Грацие в Милане в 1495–1497 годах. При помощи иллюзорных средств Леонардо расширил реальное пространство зала в область живописного пространства, с высоким столом, за которым сидят Христос и апостолы. Он изобразил тот момент, когда Христос сказал: «Истинно говорю вам, что один из вас предаст меня». Здесь Христос — центр композиции. Все средства использованы для того, чтобы подвести взгляд к фигуре Христа: и основные цвета одежды (красный и синий), и изображение Спасителя таким образом, что его силуэт выделяется на фоне окна. Фигура Иуды (четвёртый справа от Христа) смещена со своего обычного места с внешней стороны стола, что ещё более усиливает драматизм происходящего. Двенадцать апостолов распределены на четыре группы по трое и изображены либо склонёнными к Христу, либо отпрянувшими от него. Поскольку расположение тринадцати человек по одну сторону стола несколько неестественно, их прямое сопоставление поднимает эмоциональный накал, а уходящая в глубь перспектива (комната изображена в виде трапеции) создаёт эффект «выталкивания» фигур к зрителю. Возможно, черпая вдохновение у своего друга Луки Пачоли (ок. 1445–1517), для книги которого «О божественной пропорции» (1509) Леонардо сделал несколько иллюстраций, он выстроил композицию фрески по системе пропорций, аналогичной соотношениям музыкальных интервалов; эта идея впоследствии легла в основу творчества архитектора Андреа Палладио.
Деятельность Леонардо в первое десятилетие XVI века была столь же разнообразна, как и в другие периоды его жизни. Несмотря на увлечение математикой, он продолжал заниматься живописью. В это время было создано полотно «Мадонна с Младенцем и святой Анной», и около 1504 года Леонардо начал работу над своей знаменитой картиной «Мона Лиза», портретом жены флорентийского купца. Этот портрет (он находится в Лувре) является дальнейшей разработкой типа, появившегося у Леонардо ранее: модель изображена по пояс, в лёгком повороте, лицо обращено к зрителю, сложенные руки ограничивают композицию снизу.
Одухотворённые руки Моны Лизы так же прекрасны, как лёгкая улыбка на её лице и первобытный скалистый пейзаж в туманной дали. Джоконда известна как образ загадочной, даже роковой женщины, однако эта интерпретация принадлежит XIX веку. Более вероятно, что для Леонардо эта картина была наиболее сложным и удачным упражнением в использовании сфумато, а фон картины — результат его исследований в области геологии. Вне зависимости от того, был ли сюжет светским или религиозным, пейзаж, обнажающий «кости земли», постоянно встречается в творчестве Леонардо.
«Мона Лиза» создавалась в то время, когда Леонардо был до такой степени поглощён изучением строения женского организма, анатомией и проблемами, связанными с деторождением, что разделить его художественные и научные интересы практически невозможно. В эти годы он зарисовал человеческий эмбрион в матке и создал последнюю из нескольких версий картины «Леда» на сюжет античного мифа о рождении Кастора и Поллукса от соединения смертной девушки Леды и Зевса, принявшего образ лебедя. Леонардо занимался сравнительной анатомией и интересовался аналогиями между всеми органическими формами.
Из всех наук Леонардо более всего интересовали анатомия и военное дело. Почти для всех своих покровителей он создавал проекты оборонительных сооружений, которые им были крайне необходимы, поскольку в конце XV века усовершенствование пушек привело к тому, что вертикальные стены старого образца уже не выполняли своей оборонительной функции. Для защиты от пушек требовались стены с наклоном, земляные валы и разнообразные приспособления, при помощи которых можно было вести успешный оборонительный перекрёстный обстрел. Леонардо создал множество проектов, в том числе новаторский проект крепости с низкими, расположенными кругами тоннелями с амбразурами. Как и почти все его проекты в этой области, он не был осуществлён.
Важнейший из общественных заказов Леонардо был также связан с войной. В 1503 году, возможно, по настоянию Макиавелли, он получил заказ на фреску размером примерно 6 на 15 м с изображением битвы при Ангиари для зала Большого совета в палаццо делла Синьория во Флоренции. В добавление к этой фреске должна была быть изображена битва при Кашине, заказ на которую получил и Микеланджело; оба сюжета — героические победы Флоренции. Этот заказ позволил двум художникам продолжить напряжённое соперничество, начавшееся в 1501 году. Ни одна из фресок не была закончена, поскольку оба художника вскоре уехали из Флоренции: Леонардо — снова в Милан, а Микеланджело — в Рим; подготовительные картоны не сохранились.