В 1872 году Рентген женился на Анне Берте Людвиг. Анне была дочерью владельца пансиона, где жил Вильгельм во время обучения в цюрихском Федеральном технологическом институте. Отец не одобрил выбора: он видел женой сына девушку из богатой семьи. Так как сын не подчинился его воле, то он лишил его материальной поддержки. Но, несмотря на постоянную нехватку денег, супруги жили душа в душу. Не имея собственных детей, супруги в 1881 году удочерили шестилетнюю Жозефину, дочь брата Рентгена.
В 1875 году Рентген стал полным (действительным) профессором физики Сельскохозяйственной академии в Гогенхейме (Германия), а в 1876 году вернулся в Страсбург, чтобы приступить там к чтению курса теоретической физики.
Экспериментальные исследования, проведенные Рентгеном в Страсбурге, касались разных областей физики, таких как теплопроводность кристаллов, пьезо– и пироэлектрические свойства, магнетизм и др., по словам его биографа Отто Глазера, снискали Рентгену репутацию «тонкого классического физика-экспериментатора». В 1879 году Рентген был назначен профессором физики Гессенского университета, в котором он оставался до 1888 года, отказавшись от предложений занять кафедру физики последовательно в университетах Йены и Утрехта. В 1888 году он возвратился в Вюрцбургский университет в качестве профессора физики и директора Физического института, где продолжил вести экспериментальные исследования широкого круга проблем, в т ч. сжимаемости воды и электрических свойств кварца.
В 1894 году, когда Рентген был избран ректором университета, он приступил к экспериментальным исследованиям электрического разряда в вакууме.
Вечером 8 ноября 1895 года Рентген, как обычно, работал в своей лаборатории, занимаясь изучением катодных лучей. Около полуночи, почувствовав усталость, он собрался уходить. Окинув взглядом лабораторию, погасил свет и хотел было закрыть дверь, как вдруг заметил в темноте какое-то светящееся пятно. Оказывается, светился экран из синеродистого бария. Почему он светится? Солнце давно зашло, электрический свет не мог вызвать свечения, катодная трубка была выключена, да и вдобавок закрыта черным чехлом из картона. Рентген еще раз посмотрел на катодную трубку и упрекнул себя: оказывается, он забыл ее выключить. Нащупав рубильник, ученый выключил трубку. Исчезло и свечение экрана; включил трубку вновь – и вновь появилось свечение. Значит, свечение вызывает катодная трубка! Но каким образом? Ведь катодные лучи задерживаются чехлом, да и воздушный метровый промежуток между трубкой и экраном для них является броней. Так началось рождение открытия.
Оправившись от минутного изумления, Рентген начал изучать обнаруженное явление и новые лучи, названные им икс-лучами. Оставив футляр на трубке, чтобы катодные лучи были закрыты, он с экраном в руках начал двигаться по лаборатории. Оказывается, полтора-два метра для этих неизвестных лучей не преграда. Они легко проникают через книгу, стекло, станиоль… А когда рука ученого оказалась на пути неизвестных лучей, он увидел на экране силуэт ее костей! Фантастично и жутковато! Но это только минута, ибо следующим шагом Рентгена был шаг к шкафу, где лежали фотопластинки: надо увиденное закрепить на снимке. Так начался новый ночной эксперимент. Ученый обнаруживает, что лучи засвечивают пластинку, что они не расходятся сферически вокруг трубки, а имеют определенное направление…
Утром обессиленный Рентген ушел домой, чтобы немного передохнуть, а потом вновь начать работать с неизвестными лучами. Пятьдесят суток – дней и ночей – были принесены на алтарь небывалого по темпам и глубине исследования. Были забыты на это время семья, здоровье, ученики и студенты. Он никого не посвящал в свою работу до тех пор, пока не разобрался во всем сам. Первым человеком, кому Рентген продемонстрировал свое открытие, была его жена Берта. Именно снимок ее кисти, с обручальным кольцом на пальце, был приложен к статье Рентгена «О новом роде лучей», которую он 28 декабря 1895 года направил председателю Физико-медицинского общества университета. Статья была быстро выпущена в виде отдельной брошюры, и Рентген разослал ее ведущим физикам Европы.
Первое сообщение Рентгена о его исследованиях, опубликованное в местном научном журнале в конце 1895 года, вызвало огромный интерес и в научных кругах, и у широкой публики. «Вскоре мы обнаружили, – писал Рентген, – что все тела прозрачны для этих лучей, хотя и в весьма различной степени».
Вечером 6 января 1896 года из Лондона по телеграфу было передано сообщение: «Даже шум военной тревоги не в силах был бы отвлечь внимание от замечательного триумфа науки, весть о котором докатилась до нас из Вены. Сообщается, что профессор Вюрцбургского университета Роутген открыл свет, который проникает при фотографировании через дерево, мясо и большинство других органических веществ. Профессору удалось сфотографировать металлические гири в закрытой деревянной коробке, а также человеческую руку, причем видны лишь кости, в то время как мясо невидимо».