Обойдя несколько монастырей, Феодосий остался возле Антония и в 1058 г. в основанной им Печерской обители принял монашеский постриг от Никона (Иллариона, принявшего это имя в монашестве). За смиренную жизнь, трудолюбие и высокую духовность Феодосий вскоре был рукоположен в иеродиаконы, а затем и в иеромонахи. Мать, не прекращавшая поиски сына, нашла его в Печерском монастыре. Она умоляла его вернуться к светской жизни, но Феодосий в конце концов уговорил и ее принять монашество.
В 1062 г. Феодосий, с благословения преподобного Антония, стал игуменом Печерского монастыря. Возраст, воспитание и характер способствовали его бурной деятельности по развитию и расширению обители. Вскоре братия насчитывала около ста человек — довольно много не только по древнерусским понятиям, но и по меркам Византии. Такое быстрое увеличение количества монахов требовало сооружения новых келий и развития монастырского хозяйства. Нужна была большая, вместительная церковь для братии и многочисленных прихожан.
Поэтому все усилия Феодосий сосредоточил на возведении в Печерском монастыре величественного храма в честь Успения Пресвятой Богородицы. Для этого требовались значительные средства (часть которых выделил княжеский двор, остальное удалось собрать с благочестивых прихожан и гостей монастыря), материалы, утварь и умелые мастера. Большинство их пригласили из Византии. Успенский собор был заложен Феодосием, с благословения доживавшего свои дни Антония, в 1073 г., а завершен уже после их смерти в 1078 г.
При Феодосии отношения Печерского монастыря с центрами византийской церковно-монашеской жизни заметно усилились. В частности, в период его игуменства в обители приняли Студийский устав, ставший со временем нормой жизни для древнерусских монастырей. Этот устав предполагал совместное проживание монахов и требовал высокой образованности братии, при этом предоставляя право праведным старцам на затворничество.
Сам Феодосий вел суровую аскетическую жизнь. Он пользовался высоким авторитетом, уважением и любовью как монахов, так и мирян, активно занимался литературной, прежде всего богословско-назидательной и церковно-публицистической деятельностью. Сохранились 11 его произведений: 2 послания к великому князю Изяславу Ярославичу, 8 «Слов» и «Поучений» монахам и молитва «За всех христиан». Эти произведения свидетельствуют о том, что Феодосий был в курсе богословских споров, приведших в 1054 г. к разделению до того времени единой церкви на православие и католицизм. В одном из своих «Слов», написанных около 1069 г., он компетентно отстаивает православный канон, возражая против латинских нововведений.
Монашеский труд и литературные занятия Феодосий соединял с высокой нравственной позицией в политических вопросах. Он осуждал усобицы между сыновьями Ярослава, вспыхнувшие в 1068 г. и решительно порицал Святослава Ярославича, лишившего в 1073 г. власти старшего брата Изяслава и самолично занявшего великокняжеский престол, сравнивая новоиспеченного князя с Каином.
Разъяренный Святослав намеревался заточить его в тюрьму. Феодосий же, вопреки увещеваниям братии и киевских бояр, продолжал обличать неправедным путем добывшего престол князя. Святослав так и не посмел причинить зло Феодосию. Более того, он первым пошел на примирение, и стремясь задобрить праведного игумена, посетил Печерский монастырь, а затем преподнес богатые пожертвования на сооружение Успенского собора. С этого момента отношения между ними несколько наладились, хотя Феодосий продолжал уговаривать великого князя примириться со старшим братом, которого он поминал в монастырских молитвах первым, а Святослава, к неудовольствию князя, вторым.
Феодосий покинул мир через год после кончины Антония, в 1074 г., не дожив до 40 лет. Чувствуя приближение смерти, он призвал всю братию и напоследок наставлял каждого из них. Тело почившего братия перенесла в церковь, где и отпела. Весть о случившемся мгновенно облетела Киев и окрестности, и вокруг монастыря собралось множество людей. Дождавшись, когда с наступлением ночи народ разойдется, монахи перенесли тело Феодосия в ту пещеру, где он скончался. В 1091 г. его мощи разыскал преподобный Нестор. Тогда же они были перенесены в уже освященный Успенский собор Печерского монастыря. Нестор в 1080-х гг. составил первое житие Феодосия. В 1108 г. состоялась канонизация святого.
С 1131 г. нетленные мощи Феодосия покоились в серебряной, покрытой позолотой, раке. Поклониться им сходились паломники со всех концов Руси. В тревожные месяцы ожидания Батыева нашествия на Киев печерские монахи спрятали их «под спудом» собора, и точное их местонахождение до сих пор остается неизвестным.