Но жизни самой шотландской королевы завидовать не приходилось: муж ее оказался тщеславным и ограниченным человеком, к тому же пьяницей. Генри Дарнли вел разгульную и беспорядочную жизнь, так что выгодную для Англии политику он никак не мог проводить. Впрочем, он вряд ли бы мог проводить вообще какую-либо политику. Однако Г. Дарнли хотел участвовать в государственных делах и был очень недоволен тем, что Мария Стюарт отказывалась его короновать. И тогда он примкнул к заговору шотландских лордов, которые были недовольны королевой. Внешним поводом для заговора стало расположение Марии Стюарт к итальянцу Риччо, который состоял ее секретарем по французской и итальянской переписке. По характеру своих занятий Риччо был приближен к королеве, но о ревности Г. Дарнли (о которой упоминали впоследствии) вряд ли можно было говорить. Со временем Риччо стал приобретать политическое влияние, что было неудобно для шотландских лордов, и они решили устранить его, а заодно с ним и королеву, отправив ее в пожизненное заточение. А за Генри Дарнли лорды обещали сохранить наследственную королевскую власть и предоставить ему право управлять государством.
Заговор был приведен в исполнение. Риччо убили, и Мария Стюарт оказалась пленницей в руках заговорщиков. Больная и потрясенная всем произошедшим, она впала в отчаяние. Но Дарнли вскоре разочаровался в своих ожиданиях, так как лорды и не думали выполнять свои обещания. Он понял, что убийство Риччо было для них только средством поссорить его с королевой; более того, устранив ее, они потом устранят и его. И провинившийся муж бросился к Марии Стюарт с раскаянием и признанием своей вины. Королева примирилась с ним, и вместе они обдумали план избавления. Дарнли убедил мятежных лордов, что хотя бы на время нужно снять стражу, так как королева больна, а кроме того, необходимо показать народу, что она — не пленница… Лорды на ночь сняли стражу, и, воспользовавшись этим, Мария Стюарт с мужем бежала в Дунбар.
После такого коварства Дарнли заговорщикам ничего не оставалось делать, как бежать самим. Но у них в руках остался документ, подписанный Дарнли, из которого было видно, что он являлся чуть ли не главным участником заговора и покушался не только на жизнь Риччо, но и самой Марии Стюарт. Документ подавил королеву: значит, все клятвы Дарнли в своей невиновности оказались ложью. После этого его совершенно отстранили от государственных дел, чего он не мог простить королеве. Дарнли оставил двор и уехал в Глазго к отцу, но там заболел оспой. Мария Стюарт прислала ему своего врача, а потом поехала сама: ухаживала за больным и отвезла его в загородный дом под Эдинбургом. В ночь с 9 на 10 февраля 1567 года этот дом взлетел на воздух, и во время взрыва Дарнли погиб.
Вскоре после его гибели стали распространяться слухи, что убийцей является Д. Босуэлл, под командованием которого королевские силы в свое время подавили восстание протестантов, неудовлетворенных сделанными Марией Стюарт уступками. Это был человек храбрый и презиравший опасности; не ведая жалости и сострадания, он одновременно олицетворял и мужество, и жестокость. По мнению большинства биографов Марии Стюарт, королева превратилась в послушное орудие в его руках. Анонимные обвинения становились все разнообразнее, а после брака Марии Стюарт с Д. Босуэллом ее имя в них стало упоминаться чаще. Все шотландцы — без различия вероисповеданий — были потрясены, и мало кто сомневался, что новым мужем их королевы стал человек, убивший ее прежнего мужа. Волна народных возмущений породила у противников Марии Стюарт надежду на захват власти, и лорды выступили с оружием против королевы, запятнавшей себя кровью. Д. Босуэлл стал спешно собирать силы, чтобы удержать Марию Стюарт на троне, но преимущество было не на их стороне. Противники предложили королеве сдаться, пообещав ей и ее сторонникам свободный проезд — куда они пожелают. Сопротивление было бесполезным, и Д. Босуэлл уговорил Марию Стюарт сдаться.
В Эдинбурге королеву поместили не во дворце, а в помещении, где для нее даже не было зеркал. В спальне постоянно находилась стража, отказывавшаяся выходить даже при переодевании королевы. В одно раннее утро Мария Стюарт распахнула окно и стала кричать, что ее обманули, и она является пленницей. Собравшаяся толпа увидела королеву в ужасном виде: едва наброшенное платье обнажило грудь, волосы растрепались, а лицо было посеревшим. Через два дня ее под охраной доставили в замок-крепость, который располагался на острове Лохлевен, а 20 июня у слуги Д. Босуэлла был изъят ларец с письмами Марии Стюарт, в которых указывалось на ее причастность к убийству Дарнли. Правда, говорилось об этом только намеками, а вот факт любовной связи королевы с Д. Босуэллом еще до венчания сомнению не подлежал. Заполучив компрометирующие документы, правители Шотландии вынудили Марию Стюарт отречься от престола в пользу малолетнего сына.