Во время учебы Петра Лесгафта в академии состав ее профессоров был одним из лучших: кафедры и клиники возглавляли такие знатоки своего предмета, как Я.А. Чистович, Н.Ф. Здекауер, Т.С. Иллинский, А.Я. Крассовский, В.Е. Экк, П.П. Заболоцкий-Десятовский, И.М. Балинский.
С конца третьего курса Петр неожиданно увлекся анатомией и отдался ей со всей страстью. Анатомия стала делом его жизни, его неизменной и верной спутницей. Впоследствии в медицинских кругах П.Ф. Лесгафта называли «поэтом анатомии», а его учителя, профессора В.Л. Грубера, «Пименом русской анатомической школы». Венцеслав Леопольдович Грубер приехал в Россию из Праги весной 1847 года по личному приглашению Н.И. Пирогова, увидевшего в нем опытного, добросовестного прозектора, владеющего прекрасной анатомической техникой. Чех по национальности, говоривший на смеси немецкого, русского и латинского языков, он был грозой и любимцем многих поколений студентов академии. Целиком посвятивший себя изучению анатомии, он все дни проводил в наполненном удушающими миазмами помещении — препаровочной, разбираясь в многочисленных аномалиях, в открытии и описании которых он не знал себе равных в Европе. В «Автобиографических записках» И.М. Сеченов вспоминал: «Знал он одну анатомию, считал ее одним из китов, на котором стоит вселенная… Чувство долга и чувство справедливости было развито в Грубере до непостижимой для нас… степени». У Грубера, как и у Пирогова, был нелегкий характер. Они (Пирогов и Грубер) повздорили из-за пустяка и были в ссоре восемь лет.
В годы своего учения Петр Лесгафт еще не мог видеть определенную научную ограниченность В.Л. Грубера, находившегося в плену формально-описательной анатомии, господствовавшей тогда повсеместно и представлявшей собой типичный образец «мертвой» науки, требовавшей только изучения и запоминания строения и взаимного расположения множества анатомических образований.
Позднее П.Ф. Лесгафт решительно порвал с описательной анатомией и нашел выход из тупика фактологии в установлении тесной взаимосвязи между строением и функцией органов. Он стал основоположником функционального направления в анатомии. А пока Петр с похвальным упорством и редким прилежанием постигает технику препарирования и зубрит латинские названия мышц, костей и суставов.
Сдать экзамены Венцеславу Груберу считалось трудным делом. Многие приходили к нему по 10–15 раз, и значительная часть студентов ежегодно оставалась на второй год. Чтобы облегчить сдачу экзаменов, студенты литографическим способом отпечатали своеобразную шпаргалку на 32 страницах, получившую название «груберка». Без ее заучивания ни один студент не рискнул бы явиться на экзамен. Еще была книга, наводившая страх на студентов и в шутку прозванная ими «житие всех мучеников груберистики». В нее Грубер вносил отметки о сдаче анатомических препаратов, характере ответов, числе переэкзаменовок, пропусках занятий и ставил оценку за устный ответ.
Летом 1860 года в академии была открыта новая кафедра практической анатомии под руководством В.Л. Грубера. Петр Лесгафт вскоре стал одним из самых ревностных посетителей препаровочной. Скальпель и пинцет в его руках постепенно приобретали груберовскую смелость и ловкость. Это не осталось незамеченным Грубером, который стал привлекать Лесгафта к серьезным работам в качестве своего помощника: поручал ему приготовление учебных препаратов, доверял ассистировать при бальзамировании.
Сам Венцеслав Грубер говорил, что он предполагал предоставить Лесгафту штатное место, «удостоверившись в его способности быть прозектором еще в течение 1859–1860 гг….». В 1860 году за умело выполненную работу по бальзамированию тела императрицы Александры Федоровны студент 5-го курса Петр Лесгафт получил вознаграждение в размере 300 рублей. Эти деньги пришлись кстати. Поступив в академию, Петр ушел из родного дома, снял комнату недалеко от зданий клиник и зарабатывал на жизнь лишь случайными уроками. Жесткая экономия была его спутником в течение всех лет учебы.
Наконец курс медицинских наук был успешно преодолен. 10 июня 1861 года конференция Медико-хирургической академии после испытания признала лекаря Лесгафта достойным звания уездного врача. 18 июня состоялся торжественный акт, во время которого молодому врачу был вручен диплом на латинском языке об окончании им академии с серебряной медалью.
По окончании Медико-хирургической академии Петр Лесгафт был оставлен при ней и работал у В.Л. Грубера на кафедре практической анатомии прозектором. В конце 1861 года он выдержал экзамен на степень доктора медицины и хирургии. С этого же года Лесгафт стал преподавать анатомию и хирургию слушателям военно-фельдшерской школы. Одновременно он руководил практическими занятиями студентов второго курса и занимался с группой женщин-вольнослушательниц.