Дмитрий Иванович родился в семье обедневшего шляхтича, сельского псаломщика Ивана Акимовича Яворницкого 25 октября (6 ноября по новому стилю) 1855 года. Мать будущего историка была простой крестьянкой. Жила семья Яворницких в селе Солнцевка под Дергачами (сейчас с. Борисовка Дергачевского района Харьковской области). Вероятно, Дмитрий Яворницкий не представлял бы для истории Украины никакого особого интереса, если бы не случай. Отправленный в Харьков учиться сын хозяина местной экономии наотрез отказался расставаться со своим другом, так что первую плату за обучение Дмитрия внесли люди почти посторонние. Дмитрий Яворницкий поступил в Харьковское уездное училище. По окончании этого учебного заведения Яворницкий поступил в Харьковскую духовную семинарию, но быстро отказался от мысли стать священнослужителем. Его больше интересовала реальная, а не вымышленная история. Ему удается поступить на историко-филологический факультет Харьковского университета. (Кстати, при поступлении его фамилия была написана как Эварницкий — так он и фигурирует во многих документах.) Здесь он слушал лекции отличавшихся свободомыслием профессоров Сумцова и Потебни (выдающегося слависта, исследователя фольклора, историка). Под их влиянием Яворницкий увлекся историей и литературой родного края. Он окончил университет в 1881 году, и способного выпускника оставили готовиться к получению профессорского звания при кафедре истории России. Одновременно Яворницкий начал преподавать историю в 3-й харьковской гимназии.
Руководство университета предлагало Дмитрию Ивановичу работать над изучением всеобщей истории, но он интересовался в первую очередь Украиной. Уже в 1881–1882 годах вышла его первая работа — «Возникновение и структура Запорожского коша». Тема Запорожской Сечи останется ведущей во всей деятельности Яворницкого. Непревзойденный исследователь истории запорожского казачества опубликовал около 200 работ (не только строго научных). Среди них трехтомная «История запорожских казаков», «Очерки по истории запорожских казаков и Новороссийского края», «Вольности запорожских казаков», «Иван Дмитриевич Сирко, славный кошевой атаман войска запорожского низовых казаков», «По следам запорожцев», «Запорожцы в поэзии Т. Г. Шевченко», «К истории степной Украины» и др.
Строптивого аспиранта лишили стипендии, но из университета не выгнали, и он продолжил свои исследования. В отличие от многих своих предшественников Яворницкий отказывается быть «кабинетным ученым». Он отправляется в экспедицию по казаческим местам. В дальнейшем Яворницкий принимал участие в множестве таких научных экспедиций, ходил пешком, плавал по Днепру, собирал фольклор и предметы быта. Свои исследования Яворницкий стремился подтверждать всесторонним комплексным изучением любых исторических источников — этнографических, документальных и археологических, участвовал и руководил раскопками. В конечном счете он стал, пожалуй, лучшим специалистом по запорожским древностям. Коллеги Яворницкого вспоминают, что он мог интуитивно определить назначение любого предмета из быта запорожцев, который попадал ему в руки.
Те, кто имел дело с Дмитрием Яворницким, утверждают, что в своих экспедициях он не останавливался ни перед чем, все ему надо было облазить, лично пройти всеми тропа, ми взобраться на все вершины. В одной из первых экспедиций он переплыл Днепр, как делали в старину те, кого принимали в казаки. Он много раз ломал руки и ноги, простужался. Леся Украинка, встречавшаяся с историком в Египте, называла его «неугомонным дедом».
Многие биографы называют Дмитрия Ивановича ученым нового, современного типа. Его не интересовали выдумки, он не был вдохновенным фантазером, как многие историки до него. Вот только тема его занятий вызывала большое беспокойство сначала у российских, а затем и у советских властей. Запорожское казачество великодержавные правители стремились изобразить как разбойничью шайку, обреченную на погибель. По крайней мере, из их деятельности надо было всячески убирать национальные мотивы.
Весной 1884 года Дмитрий Иванович начал читать серию публичных лекций «О запорожских казаках». (В то время это была популярная форма народного просвещения. Лекции читались в университетах, а аудитория состояла из всех желающих, среди которых были жители города разных возрастов и профессий.) Лекции молодого ученого вызывают в Харькове огромный интерес, студенты носят Яворницкого чуть ли не на руках, а от экстатических, влюбленных студенток Дмитрий Иванович не знает, как и отбиться. Он читает с большим воодушевлением, с кафедры звучат даже народные песни в его исполнении. В это же время вместе с Потебней, Багалеем, Ефименко Яворницкий участвует в работе историко-филологического общества. Вся эта бурная деятельность продолжалась меньше года. За сепаратизм и украинофильство Яворницкого увольняют из университета.
В связи с этим в 1885 году историк переезжает в Петербург. Северная Пальмира оставила неизгладимый след на облике историка. По приезде он заболел воспалением мозга и полностью поседел.