Утром 11 апреля больному сделалось значительно хуже, в 12-м часу ему предложили приобщиться св. тайн, что он исполнил с полным сознанием. После причащения Николай Александрович начал со всеми прощаться. Как отмечает Литвинов, он каждого присутствующего называл по имени и говорил по два раза: «Прощай, прощай». Последний консилиум врачей, в числе которых были профессора Здекауер и Пирогов и вызванный из Вены доктор Оппольцер, пришёл к заключению, что у цесаревича цереброспинальный туберкулёзный менингит и спасения нет. Тем не менее Николаю Александровичу беспрестанно давали мускус по настоянию Пирогова, который утверждал, что доктора не должны терять надежды до тех пор, пока в больном не перестанет биться сердце. Однако мускус только мучил страдальца. В 16.00 на него нашла икота, и его беспрестанно рвало мускусом. Несчастная принцесса Дагмара, стоя на коленях перед умирающим женихом, всё время вытирала ему рот и подбородок (51а, с. 57).
В 19 часов 30 минут началась агония, во время которой невеста и брат ни на минуту не отходили от изголовья умирающего.
Три раза в его комнату приглашали духовенство для чтения отходной. Наконец во время третьего чтения с 11 на 12 апреля в 0 часов 50 минут местного времени Николай скончался. В минуту кончины августейшие отец и мать держали одну руку умирающего, принцесса-невеста и любимый брат, великий князь Александр Александрович — другую.
Лейб-медик профессор Н. Ф. Здекауер позже говорил, что бред цесаревича был характерным. Он выступал перед какими-то депутатами, в другой раз как будто брал Кексгольм приступом. Вообще смерть показала, сколько обещала его жизнь. Замечательно слово, сказанное им насчёт нынешнего цесаревича: «В нас всех есть что-то лисье, Александр один вполне правилен душой». Как признавалась императрица, последними словами цесаревича были: «Стоп машина!»
Тело царственного первенца было вскрыто и бальзамировано. Вскрытие установило не только туберкулёзный менингит, но и внутренний нарыв в спинной кости, который был основным источником болезни. Выяснилось, что итальянский доктор один был прав в своём диагнозе.
Пошли толки и догадки: откуда мог произойти этот нарыв? Тогда вспомнили, что года два тому назад наследник в присутствии всей августейшей семьи принимал участие в скачке наперегонки с принцем Ольденбургским на ипподроме в Царском Селе. Цесаревич велел положить себе новое, щёгольское, но непривычное для него английское седло и на всём скаку слетел с лошади. Он тут же вскочил на ноги; казалось, падение не оставило о себе следа. Но прирождённая ему золотуха, по всей видимости, устремилась в ушибленное место, медленно и незаметно подтачивая организм. С той поры он изредка стал жаловаться на боль в пояснице. Ложное лечение, в особенности паровые души, ускорило болезнь и уменьшило страдания.
Рано утром 12 апреля 1865 г., в пятницу, известие о смерти наследника престола по телеграфу дошло до С. — Петербурга от министра императорского двора генерал-адъютанта графа Адлерберга 2-го. Тогда же утром о печальном событии было объявлено в приложениях к газетам и сообщено в губернии по телеграфу. Это был второй случай в России, начиная с Петра Великого, когда русские теряли своего наследника престола.
В тот же день в Ницце был обнародован высочайший манифест о кончине наследника и назначении другого. Несмотря на то, что ранее было известно о тяжёлой болезни Николая Александровича, весть о его кончине потрясла все слои русского общества. И как обычно, среди народа распространялись всевозможные фантастические слухи и толки, в которых было много нелепого. В Москве стоустая молва говорила, будто цесаревича отравили великий князь Константин Николаевич или его супруга «Константиниха». В Петербурге профессору А. В. Никитенко один генерал с весьма важным видом выразил своё мнение, что в болезни, а следовательно, и в смерти наследника сильно повинен Наполеон. «Каким же это образом?» — спросил Никитенко. Говоривший не сумел этого объяснить, но всё же остался при своём мнении.
Рассказывали, например, что лейб-медик Н. Ф. Здекауер требовал тёплых ванн, а цесаревича отправили купаться на побережье Северного моря на курорт Схевенинген, что один флорентийский врач указывал на спинной мозг, как на гнездо болезни и требовал скарификации, но его не послушали, что французский хирург Нелатон поставил фонтанели, а врач наследника Шестов их закрыл, что от государя скрывали правду и что он случайно узнал от фельдъегеря о готовящейся катастрофе и т. д. и т. п.