Вскоре одна из семи мельничных сестер Ксения Павловна скончалась, и отец Серафим через три года начал присылать в свою обитель новых сестер, но не иначе как девиц. Н. А. Мотовилов свидетельствует в своих записках, что отец Серафим ему объяснил это установленное им правило поступления в мельничную обитель так: «Как я и сам — девственник, батюшка, то Царица Небесная благословила, чтобы в обители моей были бы только одне девушки!» Вдовиц, желающих поступить в обитель, отец Серафим посылал к начальнице Ксении Михайловне. В то же время батюшка отец Серафим, считавший начальницею мельничной обители Елену Васильевну Мантурову, добавил сестер до 12-ти; так, восьмой определил Прасковью Семеновну Мелюкову, крестьянскую девицу деревни Погибловой, старшую сестру Марии Семеновны; девятой — любимицу свою Ксению Васильевну Путкову (впоследствии монахиня Капитолина); десятой — Анисью Семеновну; одиннадцатой — Агафию Ивлевну и двенадцатой — Екатерину Егоровну. «Вино новое вливаю в мехи новые!» — сказал отец Серафим (записки Н. А. Мотовилова) и повел жизнь своих мельничных сестер на новых началах, по уставу, данному Самой Царицей Небесной. Сестры должны были вести строгую жизнь и заниматься кроме духовных подвигов физическими трудами. Для работ, непосильных девице, при мельнице находился еще старец работник. Найдя правило Саровских иноков, которого со всею строгостию держались в общинке матери Александры, непосильным, трудным, отец Серафим дал повседневное правило, преподанное ему Богородицею. Встав утром, следовало прочесть: один раз Достойно, трижды — Отче наш, трижды — Богородице Дево радуйся, Символ веры, потом два поясных поклона с молитвою: Господи Иисусе Христе, Сыне Божий, помилуй мя грешную! поклон поясной с молитвою; Господи Иисусе Христе, Сыне Божий, помилуй нас грешных!; после сего два поясных поклона с молитвою: Господи Иисусе Христе Сыне Божий, Госпожою Девою Мариею, Богородицею помилуй мя грешную! и поясной же поклон с молитвою: Господи Иисусе Христе, Сыне Божий, Госпожою Девою Мариею Богородицею помилуй нас грешных! В заключение этого правильца: стоя на коленах, двенадцать поясных поклонов с молитвою: Господи Иисусе Христе Боже наш, помилуй нас грешных! и точно так же на коленах, двенадцать поясных поклонов с молитвою: Владычица моя Пресвятая Богородице, спаси нас грешных! Затем читать утренние молитвы. Для трудящихся сестер можно прочитывать все это даже на ходу, в работе.
До обеда постоянно читать про себя молитву Иисусову, а после обеда — до ночи: Владычица моя Пресвятая Богородице, спаси нас!
Вечернее правило: прочитать 12 избранных (изобразительных) пустынными отцами псалмов, потом помянник, поучение и 100 поясных поклонов с молитвою: Господи Иисусе Христе Сыне Божий, помилуй нас грешных! и сто же поясных поклонов с молитвою: Владычица наша Пресвятая Богородице, спаси нас грешных! Затем повторить утреннее правильце.
На ночь должны читать опять это же правильце с молитвами на сон грядущий.
Божия Матерь запретила отцу Серафиму делать обязательным чтение Акафиста, дабы этим самым не наложить тяжести и лишнего греха на чью-либо душу.
В воскресенье дана заповедь отцом Серафимом служить пред литургией
Затем отец Серафим приказал неопустительно исповедоваться и приобщаться во все посты и, кроме того, Двунадесятые праздники, не мучая себя мыслию, что недостоин, «так как не следует пропускать случая, как можно чаще пользоваться благодатию, даруемое приобщением Святых Христовых Таин. Стараясь, по возможности, сосредоточиться в смиренном сознании всецелой греховности своей, с упованием и твердою верою в неизреченное Божие милосердие, следует приступить к искупляющему все и всех Святому Таинству».
На все начальнические послушания отец Серафим приказал назначать только девиц и никоим образом не вдов; также и в церковные должности, которые обязательно должны все быть исправляемы сестрами мельничной обители.
В заключение отец Серафим еще повелел, чтобы сестры кушали не стесняясь, когда и сколько угодно, хотя бы даже и ночью, но никогда не жили в одиночку, не были одни ни в келии, ни в дороге.
Этот устав целиком помещен в записке Н. А. Мотовилова, который несомненно и сам его исполнял, по любви к отцу Серафиму и привязанности к Дивеевской обители, но в саровских изданиях жизнеописания отца Серафима он изложен кратко, неправильно и ровно ничего не выясняет (1843 г., стр. 109).