ДНК. История генетической революции

Еще один эпохальный метод для изучения различных межбелковых взаимодействий ряд исследователей именует «интерактом». Название обозначает полный набор взаимодействий между молекулами в отдельнойклетке. Интерактом включает как непосредственные физические контакты между белками (белок-белковые взаимодействия), так и непрямые взаимодействия генов, это как минимум дважды гибридный метод. В 1989 году его разработал генетик из Университета штата Нью-Йорк в Стоуни-Брук Стэн Филдс, специализирующийся на инновационных научных технологиях, способных простимулировать научные открытия. В таком двухгибридном анализе смешиваются и стыкуются пары белков, и все происходит не на инертной матрице, а в живой дрожжевой клетке. Метод заключается в том, чтобы проанализировать взаимодействие белков in vivo в дрожжах путем связывания интересующих белков A и B с разделенными ДНК-связывающим и ДНК-активационным доменами некоторого активатора транскрипции. Конструкция «белок A + ДНК-связывающий домен» называется наживкой (bait), а конструкция «белок B + активационный домен» называется жертвой (prey). Если белки A и B взаимодействуют, то из двух фрагментов собирается функциональный активатор транскрипции, который запускает транскрипцию репортерного гена (например, вырабатывающего некий флуоресцентный белок), иначе репортерный ген не транскрибируется и сигнал не наблюдается, или, если конкретнее, когда интересующие нас белки связываются друг с другом, то активируется репортерный ген, обеспечивающий рост дрожжей.

Транскриптомика качественно расширила наши возможности в охоте на гены, провоцирующие болезни: технология микрочипов позволила выявить химическую основу конкретных заболеваний, показала различия между здоровыми и пораженными тканями как функцию экспрессии генов. Логика проста. Выполняем на микрочипе анализ экспрессии генов в обычной ткани и в раковой, находим разницу между двумя результатами, смотрим, какие гены экспрессируются в одной ткани и не экспрессируются в другой. Стоит нам определить, работа каких генов дает сбой, то есть либо недостаточна, либо чрезмерно активна, к примеру в раковой ткани, и уже можно определить мишень, а затем атаковать ее при помощи таргетной молекулярной терапии, а не неселективной химиотерапией и облучением, ведь известно что эти методы губят как больные, так и здоровые клетки.

Те же технологии позволяют различать разные формы одной и той же болезни, например раковой опухоли. Стандартная микроскопия, делающая возможной цитологические и гистологические исследования, не всегда годилась для решения такой задачи: разновидности рака, которые выглядят схоже на первый взгляд врача, могут критически различаться на молекулярном уровне. Браун, комментируя прежнюю точку зрения, в соответствии с которой все виды рака в конкретной ткани имеют один и тот же корень, говорил: «Все равно что думать, будто у любой желудочной боли одна и та же причина. Понимая различия, мы можем эффективнее лечить все эти виды рака». Например, исследования с применением ДНК-микрочипов показали чрезмерную экспрессию рецептора тирозинкиназы под названием FLT3 при некоторых формах лейкемии; такие исследования не только позволили повысить точность диагностики, но и простимулировали разработку нескольких ингибиторов FLT3, которые кажутся перспективными с клинической точки зрения.

Майкл Уиглер из лаборатории Колд-Спринг-Харбор взял на вооружение метод, при котором аккумулируется не РНК, а ДНК раковых клеток и тем самым составляется профиль генетического разнообразия опухолей. Многие виды рака обусловлены переупорядочиванием хромосом – подобное может происходить, если сегменты хромосомы случайно дублируются и возникает избыток генов, кодирующих те белки, что стимулируют клеточный рост (см. главу 14). Другие виды рака возникают из-за утраты генов, кодирующих белки-репрессоры клеточного роста. Работая по методу Уиглера, врачи делают биопсию раковых и здоровых тканей одного и того же человека. ДНК раковой ткани химически помечается красным красителем, а ДНК здоровой ткани – зеленым. Микрочипы ДНК, заправленные всеми известными человеческими генами, обрабатываются смесью из двух образцов. Как и мРНК в стандартном эксперименте с микрочипами, помеченные молекулы ДНК связываются с комплементарными последовательностями в матрице. Гены, амплифицируемые в раковых клетках, дают заметное красное окрашивание (поскольку с этим участком связывается гораздо больше молекул с красным красителем, чем с зеленым), а гены, утраченные в раковых клетках, выглядят на микрочипе как зеленые пятна (поскольку «красным молекулам» там не с чем связываться). Такие эксперименты значительно расширили список известных генов, провоцирующих рак груди и другие онкологические заболевания.