Наступил 1586 год, и затянувшиеся отношения двух королев, которые не смогли ужиться на одном острове, близились к развязке. Марию к тому времени перевели под усиленный надзор в Чартли — поместье юного графа Эссекса, пасынка графа Лейстера. Роковой случай послал в руки Уолсингема некоего молодого католика, который прибыл с континента, чтобы установить контакт с шотландкой. Он очень быстро сломался на допросах и согласился помочь контрразведке государственного секретаря создать для Марии новый канал секретной переписки, находившийся под полным контролем Уолсингема. Вскоре к ней стали непрерывным потоком поступать письма, провозимые в замок в бочонках с пивом. Мария поверила в то, что «пивовар» — честный католик, и смело отправляла через него письма, где свободно обсуждала планы испанского вторжения. Этого было вполне достаточно, чтобы склонить общественное мнение к немедленной расправе над ней. Но Уолсингем прекрасно знал, что для его государыни этих доказательств окажется мало. Он ждал момента, когда его добыча поглубже заглотнет наживку и уже не сможет сорваться с крючка. «Наживкой» стала небольшая группа молодых легкомысленных заговорщиков-католиков, вознамерившихся убить королеву Елизавету. Их лидером был Энтони Бабингтон, служивший когда-то у графа Шрусбери и лично знакомый с королевой Марией. Романисты любят изображать его влюбленным в шотландку юным пажом. Однако молодой человек скорее был честолюбцем, чем романтическим героем, и побеспокоился заранее заказать свой портрет, дабы навсегда запечатлеть лик избавителя Англии от «протестантской Иезавели». Уолсингему удалось внедрить провокатора и в этот узкий круг заговорщиков.
Летом 1586 года Бабингтон написал Марии Стюарт, посвятив ее в планы заговора. Шотландка радостно одобрила их и разразилась длинным посланием с инструкциями и советами. Ей казалось, что час осуществить великое «Предприятие» настал. Она доверила письмо «пивовару», не ведая о том, что отправила в его бочонке свой смертный приговор. В начале августа Уолсингем нанес долго готовившийся удар: Бабингтон и его друзья были арестованы, а несколькими днями позже, когда Мария Стюарт под надзором своих стражей отправилась поохотиться, ее бумаги опечатали, а секретарей арестовали. Саму королеву перевезли в новое место заключения. «Волчицу» заманили в ловушку.
Когда правительство сделало официальное заявление о раскрытом заговоре, а затем Бабингтона и его шестерых товарищей вздернули на виселицу, сняли с нее еще живыми и четвертовали, Англия вздохнула с облегчением. Страшная опасность была отвращена. Пока подданные ликовали, возносили молитвы и праздновали избавление, правительство спешно принимало меры предосторожности против возможной католической интервенции: за береговой линией и морем установили наблюдение, в графствах вооружали ополчение. Посвященные слишком хорошо знали, что с провалом Бабингтона опасность далеко не миновала.
Судьба Марии, которую теперь называла «убийцей» даже Елизавета, казалась предрешенной. Однако, предвидя множество проблем с судебным расследованием и вынесением приговора иностранной суверенной государыне, королева написала ей личное послание, убеждая шотландку искренне покаяться и признаться во всех грехах, за что ей обещали жизнь и возвращение в Шотландию. Мария, разумеется, подозревала подвох, и не без оснований, так как ее признание могло быть использовано против нее. В ожидании суда ее перевезли в Норземптон в замок Фотерингей.
Трибунал составили члены Тайного совета, тридцать шесть пэров Англии, судьи и ведущие знатоки права. Два дня длилась их дискуссия с Марией о ее подсудности их суду. В истории не было прецедента, чтобы главу одного государства судили за государственную измену монарху другого. С чисто юридической точки зрения парламентский статут об «Ассоциации» был весьма шатким основанием для такого разбирательства, однако исходившая со стороны Марии угроза для дела протестантизма, государства и национальной независимости Англии была столь велика, что юристы как общего, так и канонического права поступились буквой закона ради того, что они считали духом справедливости. Правда, это относилось только к полномочиям суда. В виновности же Марии никто не сомневался. Показания Бабингтона, ее секретарей, письма — все изобличало шотландку в том, что она была прекрасно осведомлена о планах покушения на Елизавету и испанского вторжения. Мария защищала свою жизнь с истинно королевской твердостью и достоинством, но они едва ли могли перевесить уличающие ее доказательства. Суд единогласно признал ее виновной.