Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

Свойства и применимость. Оптимальная рабочая область для такого типа покрытий для разделения белков приходится на область сильных кислот, в которой капилляры сохраняют стабильность в течение нескольких недель. На рис. 68 показано разделение 15 (!) стандартных белков в области р! от 4.5 до 11 (!) и ММ от 12000 до 77000. Эффективность достигает 700000 теоретических тарелок в течение 25 минут. Покрытия на основе ПВП для кварцевых капилляров являются высокопроизводительными и при использовании в области, кислотных pH вполне конкурируют с покрытиями на основе линейных полиакриламидов.

Рис. 68.Пример разделения белков в капилляре с ПВП-покрытием.

_{Буфер: 58.5 мМ фосфат, pH 2.0; пробы: А — бэта-лактогдобулин В, В — бэта-лактоглобулин А, С — лизоцим, D — серумальбумин человека, Е — РНК крупного рогатого скота, F — цитохром С, G — трипсиноген, Н — миоглобин кита, I — трансферрин, J — кональбумин, К — миоглобин лошади, L — карбоксиангидраза В, М — карбоксиангидраза А, N — гемоглобин, О — парвальбумин.}

9.3.2.3. Покрытие капилляров поли(этиленимином) (нанесение ионных слоев)

Поли(этиленимин) (ПЭИ) является положительно заряженным полимерным покрытием, которое закрепляется на стенке капилляра под действием электростатических взаимодействий.

Изготовление. Способ нанесения такого покрытия похож на способ нанесения покрытия из анионообменных материалов на полимерные и силикатные подложки для ВЭЖХ: при этом сначала на поверхности носителя адсорбируются первичные ПЭИ с различными ММ и концентрацией, затем производится их поперечное сшивание.

В качестве сшивающего агента служит в данном случае этиленгликольдиглицидилэфир. ПЭИ содержит сдвоенные полимерные цепи с первичными, вторичными и третичными аминогруппами в соотношении 1:2:1. Эти функциональные группы делают возможными как электростатические взаимодействия, так и поперечную сшивку.

Электроосмос. Вследствие того, что концентрация основных аминогрупп в полимере высока, в широкой области pH покрытие остается заряженным положительно, что приводит к обращению направления ЭОП. При этом абсолютные значения элетроосмотических подвижностей, которые для данных покрытий достигаются при низших pH, лежат в той же области, что и скорости потоков для необработанных капилляров при основных pH (!). Подробная ЭОП/pH — характеристика, а также зависимость от количества нанесенного ПЭИ показана на рис. 69.

Рис. 69. Зависимость ЭОП от pH (ЭОП/рН-характеристики) капилляров с нанесенным ПЭИ при различных концентрациях

Как и ожидалось, с ростом значения pH буфера ЭОП увеличивается, т. к. при этом резко ускоряется депротонирование аминогрупп. Кроме того, в данном случае нельзя также полностью влияние поверхностных исключить силанольных групп (депротонирование в щелочи!).

Применимость. Наряду с интересными свойствами по отношению к ЭОП, капилляры, покрытые ПЭИ, пригодны также для разделения белков. (Отталкивание положительно заряженных белков от стенки капилляра!). (Рис. 70).

Рис. 70. Разделение стандартных белков в капилляре, покрытом ПЭИ.

_{Буфер: 20 мМ гидроксиламин/НС1, pH 7,0: пробы: 1 — мезицилоксид, 2 — миоглобин кита, 3 — БСА, 4 — хямотрипси-моген А крупного рогатого скота, 5 — цитохром С лошади, 6 — лизоцим.}

9.3.2.4. Покрытие капилляров поли (метилглутаматом)

Исходным соединением для изготовления этого полипептидного покрытия является мономер М-карбоксиангидрид гаммаметилглутамата. Сначала проводят адсорбцию этого соединения на стенку капилляра, затем с помощью нагревания с одновременным расщеплением диоксида углерода проводят полимеризацию.

Электроосмос. Вследствие того, что нанесенный полимерный слой очень тонок, 5 ЭОП уменьшается незначительно и стенка капилляра экранируется не полностью.

Применимость. Капилляры с поли(метилглутаматовым) (ПМГ) покрытием пригодны для разделения белков. Кроме того, ими можно разделять комплексные смеси ферментов (рис 71).

Рис. 71.Разделение целлюлозного комплекса ферментов в капилляре с ПМГ-покрытием.

_{Буфер: 30 мМ фосфат, pH 7,0.}