Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

Рис. 62.Стабильность покрытий (типы "щетки"), литература Supelco.

Применимость. В капиллярах с покрытиями С8 и С18 может быть проведено разделение белков. Однако покрытия алкилсиланами имеют два больших недостатка: с одной стороны — гидрофобный характер алкильной "щетки", с другой стороны — неполное экранирование поверхностных силамольмых групп, которые все еще взаимодействуют с белками.

9.3.1.2. Арилпентафторидные покрытия

Изготовление. Синтез проводится по описанным стандартным методам с применением двухстадийной реакции: после обработки стенки гаммааминопропилтриметоксисиланом нанесенные аминогруппы обмениваются с пентафторобензоилхлоридом в сухом толуоле.

Электроосмос. Особенность арилпентафторидного (АПФ) покрытия заключается в том, что, в отличие от многих других покрытий, при нейтральном pH и средних ионных силах появляется отчетливый ЭОП (0.5 мм/с).

Применимость. Как показывают специальные хроматографические опыты, АПФ-покрытия также относятся к гидрофобным. Поэтому АПФ-капилляры можно с успехом использовать при pH 7 для разделения белков. Для тестовых смесей с белками, которые перекрывали область pH от 6.9 до 11, получали эффективность в многие сотни тысяч теоретических тарелок на метр (рис. 63). Благодаря вкладу электроосмоса в условиях проводимого анализа можно разделять как катионные, так и анионные белки за один проход.

Рис. 63. Структура АПФ-покрытия.

_{Пример разделения белков (А) с помощью покрытия АПФ; (В) — в капилляре из плавленного кварца; буфер — 200 мМ КС], pH 1; пробы: L — лизоцим, D — ДМСО, R — РНК крупного рогатого скота, Т — трипсиноген, WM — миоглобин кита, НМ — миоглобин лошади, НСА-В — карбоксиангидраза В человека, ВСА-В — карбоксиангидраза крупного рогатого скота.}

9.3.1.3. Гидрофильные гидрокоил- и полиэфирные покрытия

Изготовление. В ЖХ для разделения белков в основном используются гидрофильные фазы, например, с диол-полиэтиленгликолем (ДПЭГ) или полисахаридами. Кварцевые капилляры также можно модифицировать этими функциональными группами.

В данном случае для синтеза используются двухступенчатые реакции, на первой стадии которых применяют, например, глицидсилан. Он может впоследствии либо гидролизоваться диолом, либо соединиться с глицерином или полиэтиленгликолем (рис. 64). Нанесение углеводородов происходит на первой стадии с помощью аминофункци-ональных групп, с которыми впоследствии можно связать мальтозу с использованием, например, циано-боргидридного катализа.

Рис. 64.Схема синтеза ПЭГ-покрытия.

Электроосмос и стабильность. При покрытии диолом и полиэтиленгликолем (ПЭГ), как и ожидалось, электроосмос резко уменьшается. (В случае диола m_эоп=0.1 см²/кВс для 50 мМ фосфата и pH 6). Рабочая область для таких капилляров ограничивается значениями pH от 3 до 5. Долговременная стабильность в этих условиях достигает нескольких месяцев. При покрытии мальтозой возможна работа в области pH от 3 до 7. Вследствие того, что при нанесении аминосиланов с мальтозой реакции обмена подвергаются не все функциональные аминогруппы, при низких значениях pH поверхность заряжается положительно.

Это приводит к обращению направления ЭОП в кислотах. Кроме того, хранение капилляров в этом случае возможно только при добавлении консервантов, защищающих покрытие от повреждения микроорганизмов.

Применимость: Покрытия на основе диола, ПЭГ и мальтозы в основном используются для разделения белков в КЭ. Разделение стандартных белков показано на рис. 65.

Рис. 65.Разделение белков в капилляре, покрытом ПЭГ.

_{Буфер: 30 мМ фосфат, pH 3.8; пробы: 1 — цитохром С, 2 — лизоцим, 3 — миоглобин, 4 — трипсин, 5 — РНК, 6 — трипсиноген, 1 — химотрипсиноген.}

В заключение можно отметить, что и в случае гидрофильных покрытий капилляров или на первой стадии синтеза введенной "подложки" поверхность покрывается недостаточно плотным слоем, так что зачастую взаимодействия поверхности с пробой подавляются не полностью.

9.3.1.4. Покрытия на основе белков