Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

В качестве буферных веществ могут служить также цвиттерионные молекулы (внутренние соли), которые обладают большой буферной емкостью, но не вносят значительного вклада в общую электропроводность системы. Цвиттерионы могут образовывать ассоциаты с белками и поверхностью капилляра и, тем самым, уменьшать адсорбцию белков. За счет применения аминосульфоната, аминосульфата и, в последнее время, фосфонийсульфоната в очень высоких концентрациях в качестве добавок к фосфатному буферу в нейтральных условиях можно разделять как основные, так и кислые белки.

9.1.3. Добавка органического модификатора к буферу

Недостаток заключается в возможной денатурации белка.

9.1.4. Применение буферных добавок для разделения белков (динамическое наполнение капилляров)

Простейший метод модифицирования поверхности кварцевого капилляра состоит в добавлении к буферному раствору такого компонента, который предпочтительнее адсорбируется на поверхностных силанольных группах. Формирование такого адсорбционного слоя дополнительно влияет на ЭОП и уменьшает адсорбцию вследствие гидрофобного или электростатического отталкивания. Разделяющие системы, применяемые в основном для разделения белков в немодифицированных капиллярах, приведены в таблице 22.

Добавка ПАВ ведет, прежде всего, к увеличению эффективности разделения белков. При этом взаимодействия между молекулами различных ПАВ и пробами могут быть очень различными. С одной стороны, можно конечно обсуждать, вопрос адсорбции детергентов на биомолекулах. Следствием этого является улучшение растворимости и увеличение гидрофильного характера пробы. Наряду с этим, большую роль играет также адсорбция ПАВ на стенках капилляров. Это приводит как к увеличению гидрофильности поверхности, так, и к возможной блокировке адсорбционных центров.

При использовании катионных детергентов, например, ЦТАБ, формируется двойной электрический слой, в котором положительные заряды направлены внутрь капилляра. Тем самым достигается обращение ЭОП. Вследствие того, что поверхность заряжена положительно, адсорбция катионных белков тормозится электростатическим отталкиванием от стенки. При этом в случае основных белков достигается большое число ступеней разделения и симметричность пиков. Вообще следует обращать внимание на то, чтобы добавленным детергентом не превысить критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ).

Неионные ПАВ, например BRIJ 35, также могут быть использованы для уменьшения взаимодействия белок-стенка. Для еще большего увеличения адсорбции этих детерегенов на поверхности капилляра и полного подавления ионных взаимодействий с силанольными группами, стенка обрабатывается дополнительно условно "толстым" покрытием С 18.

Принципиально должна существовать также возможность использования в КЗЭ испытанного в классическом электрофорезе и в жидкостной хроматографии анионного ПАВ ДДСН. Однако в систематических исследованиях кислых белков оказывается, что добавка ДДСН в количествах от ррт до одного процента к пробе и к буферу приводит к очень неопределенным результатам. В общем случае не улучшается ни эффективность, ни селективность, а даже наблюдается некоторое ухудшение этих характеристик. Возможным объяснением этого может быть хорошо известное действие денатурации, оказываемое ДДСН на белок. Наряду с этим, в наблюдаемой потере селективности большую роль играет, конечно, адсорбция ПАВ на биомолекулах и связанное с этим появление заряда пробы. Первоначальная структура заряда белков может полностью исчезнуть или перекрываться этим эффектом, так что разделение в электрическом поле произойдет только лишь по адсорбированным зарядам детергентов.

Рис. 59.Катионные ПАВ.

Этот эффект был использован в ДДСН-ПААГ-электрофорезе для определения ММ белков. Этот же способ может быть реализован в капилляре и позже будет описан в главе "Капиллярный гелевый электрофорез".

Резюмируя, можно отметить, что в случае добавок детергентов для разделения белков в КЭ многообещающим представляется использование в качестве динамических покрытий в основном неионных ПАВ, т. к. они лишь незначительно изменяют структуру заряда пробы. Конечно, этот метод включает совместное действие химического модифицирования поверхности и динамического покрытия, в результате чего преимущества доступности и простоты применения буферных добавок в конце концов теряются.