Силы казачьего отряда постепенно уменьшались. Правительство Ивана IV, получив донесение о взятии Кашлыка, решило направить в Сибирь отряд из 300 служилых людей под начальством С. Д. Волховского и И. Глухова. Комплектование отряда, проходившее в Прикамье, было закончено в конце 1583 года. Не рискуя отправлять служилых людей зимним путем на конях, царь приказал задержать их до весны. Строгановым предписывалось подготовить к весне 15 стругов «со всем судовым запасом, которые б струги подняли по 20 человек с запасом».
Весной 1584 года отряд выступил из строгановских вотчин в далекий путь и только к осени прибыл в Кашлык, истощив в пути взятые с собой продовольственные запасы.
Зимой 1584/85 года в Кашлыке начался сильный голод. Летописцы сообщают: «Мнози от гладу изомроша московстии вой и казацы; и воевода князь Семен Волховской тож умре». Число казаков и служилых людей в бывшей столице Сибирского ханства резко сократилось. Только весной положение несколько улучшилось. Автор Строгановской летописи пишет: «Мнози языцы окрест живущий татаровя и остяки и вогуличи приношаху к ним многия запасы и от ловитв своих от зверей и от птиц и от рыб со всякое доволство изобилие».
Кочевавший со своим улусом в степях Кучум собирал силы, вызывал к себе татарских мурз, требуя от них помощи для борьбы с русскими. Стремясь выманить казаков из укрепленного городка и напасть на них внезапно, Кучум стал распространять слухи, что им задержан торговый караван бухарцев, направлявшийся в Кашлык. Эти провокационные слухи дошли до Ермака. С отрядом в 150 человек Ермак на стругах спешно двинулся вверх по Иртышу и дошел до татарских юрт Шиштамах, расположенных у впадения реки Шиша в Иртыш. Из расспросов татар выяснилось, что бухарского каравана на Иртыше не было. Казаки предположили, что бухарские купцы задержаны Кучумом на Вагае; они повернули обратно, поплыли вниз по течению Иртыша до устья Вагая, а затем по Вагаю поднялись до Атбашского селения. Здесь окончательно выяснилась ложность известий о бухарском караване. Казаки двинулись в обратный путь. Во время ночевки на берегу Иртыша близ устья Вагая отряд подвергся неожиданному нападению Кучума. Почти все казаки были перебиты. Раненный в рукопашной схватке с татарами, Ермак пробился к берегу, но неудачно прыгнул на край струга. Струг перевернулся. В тяжелом панцире Ермак не смог плыть и утонул. Это событие, по сведениям летописцев, произошло в ночь на 6 августа 1585 года.
Когда в Кашлыке были получены вести о гибели Ермака и находившихся с ним казаков, команду над оставшимися принял Матвей Мещеряк. Остатками московского отряда командовал помощник С.Д. Волховского Иван Глухов. В общей сложности в Кашлыке оставалось не более 150 человек. Сибирские летописи сообщают, что казаки с М. Мещеряком и стрельцы с И. Глуховым покинули Кашлык и двинулись вниз по Иртышу и Оби до притока Оби реки Соби, а оттуда северной дорогой вернулись в Россию. Автор Строгановской летописи (по списку Спасского) называет другой путь продвижения русских, покинувших Кашлык, — по Иртышу до Тобола и вверх по течению Тобола до реки Туры. Здесь казаки встретили новый русский отряд, направленный правительством в Сибирь под командой И. Мансурова, вернулись с ним на Иртыш и зазимовали в устье Иртыша в поставленном укрепленном лагере (Обском городке). Обской городок просуществовал с 1585 по 1594 год. О нем говорится в летописи Саввы Есипова, в царской грамоте 1586 года угорскому князьку Лугую, в «Наказе» 1594 года Ф. П. Барятинскому и В. Аничкову. После уничтожения Обского укрепления соратники Ермака, очевидно, переселились в другие русские городки, построенные в конце XVI века в Западной Сибири. Сохранились документы, повествующие о том, что в 20-е годы XVII века в Тюмени, Тобольске и других сибирских городах жили конные казаки, находившиеся в Зауралье с «самого Сибирского взятья». Известно, что тобольский архиепископ Киприан, составляя Синодик, расспрашивал участников похода Ермака «како они приидоша в Сибирь и где с погаными были бои и ково где убили погании на драке». Казаки составили «Написание», в котором рассказали о борьбе казачьей дружины против сибирского хана Кучума.
Колонизация Сибири
После гибели Ермака и ухода казаков из бывшей Кучумовой ставки Кашлык занял сын Кучума Алей, пытавшийся восстановить власть узбекских шейбанидов над населением Западной Сибири. Против Алея выступил потомок тайбугинов Сейдяк. Борьба шейбанидов и тайбугинов разгорелась с новой силой, нанося урон хозяйству местного населения. Сейдяку удалось выбить Алея из ханской ставки и завладеть Кашлыком. Он завязал связи с мурзой Карачей и султаном одной из казахских орд, враждовавших с Кучумом.