Еще большей терпимостью к православию отличался в начале своего правления король Сигизмунд Август. При нем в Польшу, а затем в Литву стал проникать протестантизм. Покровительствуя последнему, Сигизмунд не отказывал в своей защите и православным, даровав в своем государстве всем христианским исповеданиям свободу. При нем же в 1563 г. было отменено постановление Городельского сейма (1413), по которому «схизматики не могли иметь никаких прав и преимуществ и не могли занимать никаких высших должностей», и православные, воспользовавшись всеми государственными правами, наполнили, хотя на время, разные учреждения и засели в сенате. Но при всем доброжелательном отношении к православию, Сигизмунд II много вредил ему своим произволом в раздаче церковных должностей. Произвол в этом деле доходил у него до небывалых размеров. Нуждаясь в деньгах для своей роскошной жизни, Сигизмунд И нередко продавал церковные должности за деньги, начиная с кафедры митрополита, разным недостойным лицам. Против такого произвола восстал митрополит Иона Протасевич. В своей грамоте, посланной в 1568 г. Сигизмунду Августу, присутствовавшему в то время на Гродненском сейме, митрополит просил короля, чтобы в землях, ему подвластных, духовные достоинства не раздавались светским лицам и чтобы, если кто из светских получит духовное достоинство и в течение трех месяцев не примет духовного сана, епископы могли в своих епископиях отбирать у таковых достоинства и отдавать людям духовным. Эта просьба митрополита вызвана была теми не единичными случаями, что некоторые светские лица, получив от короля духовное достоинство, например архимандрию, управляли монастырем и получали с него доходы, не принимая духовного сана. Король изъявил согласие на эту просьбу, признав ее справедливой, однако, своих прав на отдачу духовных мест не ограничил, подтвердив, что о таковых случаях владыки должны немедленно доносить ему, и он сам, отбирая у непосвященных достоинства, будет отдавать другим «по своей господарской воле», кому захочет.
Веротерпимость Сигизмунда Августа привела Литву и Западную Русь к тому, что в них весьма быстро стали распространяться протестантство и другие секты, враждебные Риму. К концу правления Сигизмунда протестантство и кальвинизм до того усилились в Литве и Польше, что из нескольких сот католических приходов в Литве уцелело от протестантства едва шесть. По словам знаменитого польского проповедника Скарги, католик был в то время редкостью во всей Литве, особенно между панами, и католический ксендз не мог безбоязненно показываться на улицах г. Вильны. Польские монастыри пустели, ксендзы спешили жениться, и католичество в Литве приходило в окончательный упадок. Распространявшиеся в Литве протестантство и кальвинизм причинили значительный вред и православию, увлекая к себе множество православных вельмож; несмотря, однако, на это, большая часть магнатов и весь православно-русский народ сохраняли в неприкосновенности не только свою веру, но и свои святыни. В Северо-Западной Руси и Литве при Сигизмунде Августе упоминается свыше 95 православных монастырей и церквей. Православные ведут борьбу как с протестантами, так и с католиками, учреждают братства, школы, книгопечатни и богадельни.
В правление Сигизмунда II Августа нашли себе приют у гетмана Григория Ходкевича, сына основателя Супрасльского монастыря, первые московские книгопечатники диакон Иван Федоров и Федор Мстиславцев, бежавшие в Литву от ярости московской черни. В учрежденной по их инициативе в имении Ходкевича в Заблудове, близ Белостока, типографии они напечатали «Евангелие учительное» (1568—1569). Там же Федоров после выезда Мстиславцева в Вильну напечатал «Псалтирь», а затем в 1581 г. в г. Остроге, в типографии князя Константина Ост-рожского, первую печатную Библию. Мстиславцев же продолжал работать в Вильне, в основанной православными братчиками Мамоничами типографии.
При таких благоприятных условиях для православия в Литве, при том же короле Сигизмунде II, произошли события, которые впоследствии нанесли тяжелый и непоправимый удар православию и открыли новые пути к его подчинению Риму. Такими событиями были Люблинская политическая уния и призвание в Литву иезуитов.