Наиболее важными и тесно связанными с изучением обмена веществ были исследования ферментов как индивидуальных химических соединений. Существовавшие до 20-х годов XX в. сомнения относительно их белковой природы были рассеяны после разработки американским биохимиком Дж. Самнером (1926) метода кристаллизации ферментов и получения кристаллической уреазы. В следующем десятилетии было получено большое число кристаллических ферментов (Дж. Самнер, Дж. Нортроп и У. Стенли — Нобелевская премия, 1946) и все они оказались белками. Новый метод получения чистых препаратов ферментов значительно ускорил исследования кинетики ферментативных реакций и свойств отдельных ферментов.
В 40-е годы начинают интенсивно разрабатываться новые методы исследований, в первую очередь физико-химические. Они знаменовали начало радикальных изменений в осуществлении исследовательского поиска и создание новой экспериментальной техники. Возможность использования автоматического и полуавтоматического лабораторного оборудования, созданного в 50-х годах с использованием принципов, разработанных в предвоенные годы, вызвала бурный рост биологической химии, который она переживает в настоящее время.
В 20-х годах Т. Сведбергом (Нобелевская премия, 1926) были построены первые аналитические ультрацентрифуги с масляными роторами, представлявшие собой гигантские сооружения. С их помощью были получены первые сведения о форме и размерах белковых молекул. В 30-е годы А. Тизелиус (Нобелевская премия, 1948) разработал метод электрофореза в свободной фазе, блестяще примененный Г. Теореллем (Нобелевская премия, 1955) для исследования природы взаимодействия кофермента и апофермента. В 1940 г. А. Мартин и Р. Синг (Нобелевская премия, 1952), использовав идею, высказанную в 1913 г. русским физиологом М.С. Цветом, разработали метод хроматографии на бумаге. Этот принцип, введенный впоследствии и в электрофоретические исследования, произвел настоящую революцию в аналитической биохимии.
Понятие «биоэнергетика» ввел в науку А. Сцент-Дьёрдьи, выпустивший в 1957 г. монографию под тем же названием. Термин «биоэнергетика» признан наилучшим 11 лет спустя группой ведущих специалистов по биохимии дыхания и фотосинтеза, собравшихся в Полиньяно (Италия), чтобы определить новую область биологии, связанную с изучением молекулярных механизмов энергетического обмена клетки.
Проникновение на молекулярный уровень организации обличает биоэнергетиков от физиологов и биохимиков, изучавших внешние суммарные показатели и спецификацию химических реакций энергетического обмена организма. Биоэнергетика ставит перед собой два вопроса: какие именно молекулы среди всего разнообразия природных соединений ответственны за превращение энергии в клетке, и каким образом они выполняют свою функцию.
Первая из упомянутых проблем уже решена применительно к большинству биологических процессов трансформации энергии. Начало этому направлению было положено в середине 40-х годов, когда В.А. Энгельгардт и М.Н. Любимова обнаружили АТФазную активность нерастворимого мышечного белка миозина. Авторы сделали вывод о том, что именно миозин ответствен за трансформацию химической энергии АТФ в механическую работу мышц. Впоследствии эта мысль получила полное подтверждение в работах многих исследователей, показавших, что гидролиз АТФ вызывает конформационное изменение актомиозинового комплекса, что в свою очередь вызывает сокращение мышечного волокна. В дальнейшем выяснилось, что и многие другие типы трансформации энергии в клетке осуществляются посредством нерастворимых белковых комплексов, которые обычно встроены в те или иные мембранные образования.
Последнее обстоятельство определяет тесную взаимосвязь и взаимопроникновение биоэнергетики и биологии мембран как новой отрасли современной биологии.
В 1949 г. А. Ленинджер в США показал, что важнейший процесс аккумуляции энергии — окислительное фосфорилирование, открытое в 1930 г. В.А. Энгельгардтом, — локализован в митохондриях, имеющих две мембраны — внешнюю и внутреннюю. В начале 60-х годов выяснилось, что внутренняя мембрана митохондрий служит носителем ферментов окислительного фосфорилирования. Вслед за этим было показано, что фотофосфорилирование, обнаруженное в середине 50-х годов Д. Арноном (США), также локализовано в структурных мембранах, а именно в тилакоидах хлоропластов. Мембранная локализация ферментов окислительного фосфорилирования и фотофосфорилирования оказалась характерной для микроорганизмов.
Роль мембран в окислительном фосфорилировании представлялась неясной в рамках традиционных «химических» гипотез энергетического сопряжения, постулировавших, что процессы переноса электронов и образования АТФ связаны между собой через промежуточный продукт неизвестной химической природы. Подобные взгляды развивались в 40-е годы Ф. Липманом (Нобелевская премия, 1953), а затем Э. Слейтером и Б. Чансом (США) и др.