В царствование Валентиниана II он является грозным сокрушителем язычества: язычество коренилось гораздо сильнее на Западе, нежели на Востоке. Самые знатные римляне еще держались своей старой религии — не из убеждения в ее истине, но из гордого чувства не хотели отступить от предания своих предков. Язычество не служило препятствием для назначения на самые высшие должности. В самом сенате римская знать разделялась на две партии, христианскую и языческую, и между ними шла ожесточенная борьба по поводу жертвенника золотой статуи Победы, который с незапамятных времен стоял в сенате, но был уничтожен еще по повелению императора Константина. Языческая партия всячески ходатайствовала перед новым императором Валентинианом II о восстановлении жертвенника. Тогда Амвросий сказал свое слово, проникнутое сознанием конечного торжества той истины, в защиту которой он грозно возвышал свой голос. "Епископ, — писал он императору, — не может допустить решение, противное Церкви. Если ты уступишь их просьбе, то будешь уже этим самым отлучен от Церкви. Идти в церковь ты можешь — но там ты не найдешь священника, или найдешь такого, который воспротивится тебе!" Император не принял ходатайства язычников.
Язычество не было уничтожено, но видимо угасло. Борьба с язычеством не потребовала от Амвросия особенных усилий, но против арианского двора пришлось ему вести борьбу долгую и многотрудную.
Императрица Иустина была убежденная, страстная арианка. Она окружила себя арианским духовенством и с негодованием смотрела на постепенное исчезновение арианства в Италии под влиянием великого епископа Миланского. В 385 году, на праздник Пасхи, она потребовала от епископа, чтобы он уступил арианам сначала загородную базилику, а затем и самую большую церковь в городе. Амвросий спокойно, но решительно отказал. Два раза посланные от императрицы заявили ему, что он не может не уступить императорской власти. Амвросий отвечал, что он готов расстаться со всем, что принадлежит ему лично, даже со своею жизнью, но что не в его воле уступить святыню. "Храм Бога не может быть оставлен священником, и император не имеет власти над тем, что принадлежит Богу". Население города пришло в крайнее возбуждение; народ схватил одного арианского пресвитера на улице и вероятно убил бы его, если бы сам Амвросий за него не вступился. Солдаты, посланные занять церковь силой, обнаружили расположение перейти на сторону православных: многие из них прямо заявляли, что пришли в церковь лишь для того, чтобы присоединиться к молитвам епископа.
Императрица должна была уступить; но Амвросий чувствовал, что борьба еще не окончилась.
В следующем же году православный мир был повергнут в ужас императорским указом, которым предоставлялась арианам полная свобода иметь свое богослужение во всех церквах, а за всякое противодействие угрожалось смертью. Вслед за этим было повторено требование о передаче Миланской базилики арианам. Без страха епископ вошел в борьбу с грозной силой императорской беспредельной власти: он оставался непоколебим в своем решении, повторяя, что он не откажется от наследия своих отцов. Ему велено было оставить город, но он твердо отказался оставить свою паству. По просьбе народа, опасавшегося за жизнь его, он несколько дней и ночей провел безвыходно в церкви среди плачущей и молящейся толпы: ее молитва, как говорил он сам, была ему защитой. Военная стража, стоявшая вокруг церкви, позволяла всем входить в церковь, но никому не позволяла выходить из нее. Наконец поняла императрица свое бессилие. Победа епископа была полная.