Прохор с детства любил церковные службы и храм. Выучившись грамоте, он читал сверстникам вслух Священное Писание и жития святых. В отрочестве он сблизился с чтимым в Курске юродивым, и под его влиянием у него окрепло намерение оставить мир. В 16 лет он отпросился у матери уйти в монастырь. Агафия благословила его медным распятием, которое он свято хранил всю жизнь и носил его на груди. Вначале юноша вместе с богомольцами отправился в Киев на поклонение Печерским угодникам. Живший в Китаевской пустыни возле Лавры прозорливый затворник схимонах Досифей благословил ему идти в Саров. Вернувшись в Курск и простившись с матерью и родными, юноша отправился в Саровскую пустынь, и пришел туда 20 ноября 1778 года при настоятеле старце
Отец Пахомий ласково принял Прохора и отдал его в научение казначею обители иеромонаху Иосифу. Под его руководством Прохор проходил послушание в хлебне, просфорне, столярне, нес обязанности пономаря и все исполнял с усердием и послушанием. По примеру других иноков, в свободное время он уходил в лес и в полном уединении творил молитву Иисусову.
В 1780 году послушник заболел водянкой - тело его распухло, больной испытывал тяжкие страдания в течение трех лет. Собратия хотели вызвать к нему врача, но Прохор попросил не делать этого, сказав: «Я предал себя Истинному Врачу душ и телес Господу нашему Иисусу Христу и Пречистой Его Матери». Старец Иосиф отслужил о его здравии Всенощную и Литургию. Прохор исповедался и приобщился Святых Христовых Тайн. После причастия ему было видение: в несказанном свете явилась Божия Матерь с апостолами Петром и Иоанном и, указав на больного, сказала: «Сей от рода нашего». Богородица возложила руку на его голову и вскоре после этого он выздоровел. На месте явления была построена больничная церковь с приделом во имя преподобных Зосимы и Саввания Соловецких. Престол для придела исцеленный соорудил своими руками из кипарисового дерева, и причащался в нем Святых Тайн.
После восьми лет послушничества, в 1786 году Прохор был пострижен в мантию с наречением имени
Однажды за Литургией в Великий четверг преподобный лицезрел Спасителя в окружении Небесных сил, идущего от западных дверей храма к алтарю. Дойдя по воздуху до амвона, Господь благословил служащих и молящихся и вступил в местный образ справа от Царских врат. Охваченный духовным восторгом, преподобный Серафим не мог сказать ни слова. Его под руки увели в алтарь, где он простоял неподвижно три часа. После видения он усилил подвиги и ночи проводил в молитве в лесной келлии за стенами монастыря.
2 сентября 1793 года в Тамбове святой Серафим был рукоположен в сан иеромонаха, и с этого дня стал служить ежедневно. После кончины настоятеля отца Пахомия, преподобный Серафим по его предсмертному благословению и с согласия нового настоятеля удалился в пустынную келлию в дремучем лесу. Одежда его была самой убогой, на голове - поношенная скуфья, на плечах - балахон из белого полотна, на ногах - кожаные бахилы и лапти, а на груди - медный материнский крест. А за плечами в сумке он неразлучно носил Евангелие. В течение недели святой прочитывал Новый Завет, читал святоотеческие и богослужебные книги, выучил наизусть много песнопений и воспевал их, работая на огороде или в лесу. Питался он один раз в день, а в среду и пятницу совершенно воздерживался от пищи. В первую неделю Великого поста преподобный не принимал пищи до субботы.
В монастырь он приходил по субботам и под праздники на Всенощную и Литургию. Навещавшие его пустынножитель схимонах Марк и иеродиакон Александр заставали его часто неподвижным, ничего не слышащим и не видящим, погруженным в умную молитву. В летнюю жару преподобный Серафим собирал мох для удобрения огорода на болоте, где его нещадно кусали комары. Около трех лет он питался только травой снитью, которая росла вокруг келлии. Кроме братии, к преподобному начали приходить и миряне за советом и утешением. Это нарушало его уединение, и святой старался избегать посещений. Встретив кого-нибудь в лесу, он кланялся и отходил, ибо, как он говорил впоследствии, «от молчания никто никогда не раскаивался». По его молитве дорогу в келлию преградили сучья вековых сосен. С этих пор его келлию, кроме монахов, посещали только птицы и дикие звери. Преподобный инок из рук кормил приходившего к нему за хлебом медведя, которого не раз видели издали возле старца.