Следующим острожским изданием стала «Книга Нового завета» (1580), содержащая псалтырь и новозаветные тексты. Изданная малым форматом и напечатанная мелким полукурсивным шрифтом, книга предназначалась не для литургической службы в церкви, а для домашнего чтения. По замыслу издателей, она должна была стать подспорьем в устной и письменной полемике с католическими богословами. Это подтверждается тем, что к части экземпляров «Книги Нового завета» приложен составленный Тимофеем Михайловичем алфавитный предметный указатель. Таким образом «Книга Нового завета» — первое отечественное издание, сопровожденное научно-вспомогательной информацией.
Среди изданий Ивана Федорова самым большим по объему и самым совершенным по уровню полиграфического исполнения стала Острожская библия, законченная в 1581 г. Подготовка текста к изданию потребовала большого кропотливого труда. Такую работу выполнил Иван Федоров вместе с Герасимом Смотрицким, Тимофеем Михайловичем, учеными-греками Дионисием Палеологом, Евстахием Нафанаилом из Кандии и др. В основу издания был положен полученный К. Острожским от царя Ивана IV из Москвы церковнославянский список в Геннадиевской редакции. Те книги, которые в Геннадиевской Библии были переведены не с греческого, а с латинского текста, острожские редакторы сверили с греческим текстом. При редактировании некоторых текстов использовалось чешское издание Библии. Перед началом основного текста помещено предисловие и вирши Г. Д. Смотрицкого. В последних открыто говорилось о тяжелом положении украинского и белорусского народов под гнетом Речи Посполитой, звучал призыв борьбы против духовного порабощения народа «хищными волками» — слугами господствовавшей в стране католической церкви.
Острожское издание, отредактированное на высоком научном уровне острожскими филологами, стали считать образцовым не только на Украине, но и далеко за ее пределами. Через 82 года после выхода в свет Острожской библии она была перепечатана в Москве, ее неоднократно, лишь с незначительными изменениями, переиздавали и позже.
Еще до окончания работы над Библией, 5 мая 1581 г., в Остроге была напечатана «Хронология» — силлабические вирши белорусского поэта-кальвиниста Андрея Рымши. Таким образом, Иван Федоров впервые на Украине стал печатать не только прозаические, но и стихотворные произведения с указанием их авторов.
Вскоре после завершения «Библии» Иван Федоров вернулся во Львов, где 5 декабря 1583 г. умер в домике портного Антоха Абрагамовича, принимавшего впоследствии активное участие в общественно-политической деятельности украинских горожан. Похоронили Ивана Федорова в Онуфриевском монастыре. О понимании современниками значения деятельности первопечатника свидетельствует текст на надгробной плите: «Иван Федорович друкар москвитин который своим тщанием друкование занедбалое обновил… Друкар книг пред тым невиданных…».
Вся издательская деятельность Ивана Федорова служила назревшим задачам культурной и общественно-политической жизни. Именно поэтому он смог внести столь значительный вклад в развитие украинской культуры. в укрепление русско-белорусско-украинских культурных связей.
Дальнейшее развитие книгопечатания.
Основную часть типографского оборудования, которое Иван Федоров в свое время отдал в залог ростовщикам, выкупили Львовские горожане. Сбор средств для выкупа типографии проводился устроителями Успенского братства — ведущей общественно-политической организации украинских горожан во Львове. Уже в 1589 г. оборудование типографии Ивана Федорова поступило в братскую типографию, где доски с федоровскими гравюрами употреблялись вплоть до конца XVIII в.Первое книжное издание Львовской братской типографии — греческо-церковнославянская грамматика «Аделфотис» — вышло в 1591 г. В первые десятилетия своей деятельности типография Львовского братства выпускала преимущественно книги светского содержания, в частности, сборники виршей «Просфонима» (1591), «Лямент на смерть Григория Желиборского» (1615), «Вирши» П. Берынды (1616), драматические произведения «Христос пасхон» А. Скульского (1630), «Размышление» И. Волковича (1631). В 1608 г. было напечатано воззвание — призыв бороться против национально-религиозного угнетения и поддерживать просветительную деятельность братства. В течение длительного времени Львовская братская типография служила подлинной школой мастерства для целой плеяды работников типографского дела. Уже в первых братских изданиях в заглавиях и в прописных буквах текста начали применять упрощенный по начертанию шрифт, ставший впоследствии одним из прототипов «гражданских» шрифтов начала XVIII в.