Во второй половине 80-х годов XVI в. деятельность Острожской типографии возобновилась. Кроме букварей она выпустила ряд публицистических произведений, направленных против насаждения католицизма и унии. Для успешного развертывания полемики против идеологической экспансии католицизма большое значение имела публикация произведений византийских авторов — Василия Великого «Книга о постничестве» (1594), Иоанна Златоуста «Маргарит» (1595, перепечатана в Москве в 1641 г.), императора псевдо-Василия «Тестамент сыну Льву» (в составе сборника «Лекарство на оспалый умысл чоловчій», напечатанного в 1607 г. с параллельными украинским и церковнославянским текстами). Всего в Остроге было издано 28 книг, из них половина на церковнославянском языке, игравшем роль «высокого стиля» литературного языка, 6 — на украинском литературном языке того времени, 4 — на церковнославянском языке с фрагментами на украинском — предисловиями, вступительными «виршами на герб» и т. п. В 1603–1605 гг. Острожская типография размещалась в Дерманском монастыре, где издательским делом руководил Демьян Наливайко.
В 1604–1606 гг. действовали типографии Гедеона и Федора Балабанов в Стрятине (близ Рогатина) и Крылосе (близ Галича). Крыл осекая типография, одним из руководителей которой был Вениамин, впервые в практике восточнославянского книгопечатания применила сюжетные иллюстрации, вмонтированные в текст книги (до того употреблялись только орнаментальные гравюры и целостраничные портреты).
Основателем книгопечатания в Киеве стал Елисей Плетенецкий — выходец из львовских мещан, бывший многие годы архимандритом Киево-Печерской лавры. Будучи высокообразованным человеком своего времени, он осознавал необходимость распространения книгопечатания не только для укрепления позиций православной церкви, но и для просвещения вообще. Он купил «присыпанное пылью» оборудование Стрятинской типографии, устроил для нужд типографии бумагоделательное предприятие в Радомышле. Первыми изданиями Киево-Печерской типографии стали «Часослов» для школьного обучения (1616), произведение Александра Митуры «Визерунок цнот» (1619) — панегирик в честь Е. Плетенецкого и, наконец, монументальный «Анфологион» (1619) — сборник текстов праздничных служб. Над переводом этих текстов с греческого языка трудились выдающиеся литературные деятели и филологи Иван (Иов) Борецкий, Захария Копыстенский и Памво Берында. Публикация этой роскошно оформленной книги, насыщенной сведениями о праздниках и традициях восточной церкви, имела вполне определенную антикатолическую направленность. Вскоре публикуются полемическая «Книга о вере» З. Копыстенского (включавшая украинский перевод двух «Слов на латинов» Максима Грека), монументальные «Беседы» Иоанна Златоуста о посланиях (1623) и деяниях (1624), «Толкования на Апокалипсис» (1625). Эти издания также имели целью дать достойный отпор писаниям сторонников католицизма. «Триодь постная» (1627) содержала кроме церковнославянского текста «синаксари» (повествовательные статьи) на украинском языке, переведенные Тарасием Земкой с греческого оригинала. Эта «Триодь», как и издания следующих лет («Триодь цветная», 1631 г., украинский перевод «Евангелия учительного», 1637 г.), украшена многочисленными иллюстрациями, часть которых отражает реальные подробности быта тех времен. К числу наиболее известных киевских изданий относятся знаменитый «Лексикон славеноросский и имен толкование» П. Берынды (1627), «Патерикон» Сильвестра Косова (1635), «Тератургима» Афанасия Кальнофойского (1638), иллюстрированная планами Киева. Издавались также школьные декламации учеников Киевского коллегиума. Типичный пример — книга И. Калимова «Sol post occasum oriens», изданная по случаю посещения П. Могилой класса риторики в коллегиуме. Несомненным достижением лаврской типографии было освоение техники глубокой печати (для печати гравюр на меди). Следует также отметить, что типография Киево-Печерской лавры оказала большую помощь в организации первой типографии в Молдавии, послав туда типографское оборудование и мастера Самуила Рогаля.
Лаврская типография не была единственной в Киеве. В 1625–1628 гг. здесь работала еще типография киевского горожанина и одновременно реестрового казака Тимофея Вербицкого, в 1628–1630 гг. — типография мастера из Белоруссии Спиридона Соболя.