В феврале-марте 1967 года два экипажа прошли интенсивную подготовку. Владимир Комаров и Юрий Гагарин осваивали навыки сближения и стыковки кораблей на специальном тренажере «Волга», а члены экипажей отрабатывали свои действия по переходу из корабля в корабль в термобарокамере ТБК-60 и на борту самолета «Ту-104», способного имитировать кратковременную невесомость. 14–15 марта первый экипаж одолел тридцатичасовую комплексную тренировку, а 17–18 марта то же самое проделал и второй экипаж.
16 марта, в перерыве между тренировками, инженер-полковник Владимир Михайлович Комаров, который был безусловным лидером программы «Союз», отпраздновал свой сорокалетний юбилей. Некоторые отговаривали его от этого шага: есть поверье, что сорок лет отмечать нельзя – быть беде.
25 марта состоялось заседание Военно-промышленной комиссии Совета министров, на котором обсуждалась готовность кораблей и экипажей. Общий вывод был таков: техника и космонавты могут быть готовы к осуществлению группового полета «Союзов» со стыковкой в период с 20 по 28 апреля. По первенству экипажей решение не принималось, но все молча согласились, что первым будет экипаж Комарова. После заседания остался узкий круг высокопоставленных членов комиссии, и Николаю Петровичу Каманину сообщили под большим секретом, что в правительстве высказываются против возвращения Юрия Гагарина в космонавтику. Позднее Каманин запишет в своем дневнике (27 марта 1967 года):
30 марта оба экипажа сдали теоретические экзамены на отлично, а 8 апреля прибыли в Тюратам. В течение двух недель космонавты участвовали в предстартовой подготовке: обживали «Союз», меняли индивидуальные ложементы, подгоняли шлемофоны, надевали и снимали скафандры. 20 апреля состоялось заседание Госкомиссии, на котором были утверждены экипажи: основной – экипаж Владимира Комарова, дублирующий – экипаж Юрия Гагарина.
23 апреля 1967 года в 3:35 по московскому времени стартовал пилотируемый корабль «Союз-1» («7К-ОК(А)» № 4) с Владимиром Комаровым (позывной «Рубин») на борту. 24 апреля с восстановленной 31-й площадки должен был состояться запуск корабля «Союз-2» («7К-ОК(П)» № 5). Однако сразу после выведения «Союза-1» на орбиту начались проблемы. Не раскрылась левая панель солнечных батарей. Не работала солнечно-звездная ориентация, поэтому не прошла автоматическая закрутка корабля, что, в свою очередь, привело к разрядке аккумуляторов. Владимир Комаров несколько раз пытался выполнить закрутку вручную, но безуспешно. Госкомиссия, проанализировав ситуацию, приняла решение отменить запуск «Союза-2» и посадить «Союз-1» досрочно. На шестнадцатом витке космонавту были переданы все инструкции, и он начал готовиться к спуску, однако не сработала система ионной ориентации, двигатель не включился, и посадка сорвалась. Лишь на девятнадцатом витке Комаров сумел свести корабль с орбиты.
После разделения отсеков и торможения спускаемого аппарата в высших слоях атмосферы отстрелилась крышка люка контейнера основного парашюта, тормозной парашют раскрылся, но вытянуть большой купол из контейнера не смог. Согласно логике работы в действие был введен запасной парашют, но и он не раскрылся, попав в аэродинамическую «тень» тормозного парашюта. В результате спускаемый аппарат со скоростью 50 м/с врезался в землю, разбился и загорелся от перекиси водорода из лопнувших баков. Летчик-космонавт Владимир Михайлович Комаров погиб.