Бактериологическое оружие применялось против СССР и МНР во время необъявленной войны на Халхин-Голе. В ходе военных действий японскими войсками использовались как боевые средства бактерии брюшного тифа, паратифа, дизентерии путем заражения реки Халхин-Гол.
В 1939–1940 гг. по специальному секретному указу императора «отряд № 731» был реорганизован и расширен. На стратегических направлениях, выводящих к границе СССР, создавались четыре филиала в городах Хайларе, Суньу, станциях Хайлин и Линькоу. Основная задача филиалов состояла в подготовке к широкому применению бактериологического оружия. С мая 1940 г. Квантунская армия приступила к применению такого оружия против китайских войск и мирного населения Китая. Существуют данные о том, что в 1941–1942 гг. в результате бактериологических атак в Китае неоднократно возникали эпидемии чумы. Их жертвами стали сотни людей.
Подготовка к ведению бактериологической войны еще больше усилилась после нападения гитлеровской Германии на Советский Союз. Как свидетельствуют «Материалы судебного процесса по делу бывших военнослужащих японской армии, обвиняемых в подготовке и применении бактериологического оружия», «в 1941 г., после вероломного нападения гитлеровской Германии на СССР, японские милитаристы, выжидая удобного момента для вступления в войну против Советского Союза, деятельно форсировали развертывание и подготовку в Маньчжурии бактериологических отрядов и их филиалов, созданных для ведения бактериологической войны».
В соответствии с планом «Кантокуэн» была организована специальная подготовка кадров офицеров и унтер-офицеров по освоению и применению бактериологического оружия. Бывший начальник ветеринарной службы Квантунской армии генерал-лейтенант Такахаси Такаацу показал на судебном процессе: «После выхода в свет оперативного плана “Кантокуэн” при штабе каждой армии, находившейся в Маньчжурии, были созданы “эпизоотические” отряды. Начальниками этих отрядов были врачи – специалисты-бактериологи, направленные из отряда № 100… Инициатором создания таких отрядов являлось первое оперативное управление генерального штаба японской армии… Задачами эпизоотических отрядов являлись подготовка и ведение бактериологической войны и диверсий против Советского Союза…»
Генерал Исии разъяснял сотрудникам «отряда № 731», что «мероприятия по расширению производства бактериологического оружия необходимы в связи с изменившейся международной обстановкой, т. е. началом войны Германии против Советского Союза и введением в Квантунской армии плана «Кантокуэн»».
После начала германо-советской войны начальник генерального штаба направил в Квантунскую армию приказ, который требовал форсировать работы по исследованию бактерий чумы, как основного средства бактериологической войны. В приказе особо отмечалась необходимость массового выращивания блох – переносчиков чумных болезней. Один из командиров «отряда № 731» Ниси Тосихидэ следующим образом характеризовал готовность Японии к бактериологической войне против СССР: «К моменту нападения Германии в 1941 г. на Советский Союз и сосредоточения Квантунской армии в Маньчжурии на границе Советского Союза, в отряде № 731 научно-исследовательские работы по созданию эффективных средств бактериологического нападения были в основном решены, и дальнейшая деятельность отряда шла по линии усовершенствования процесса массового производства бактерий и способов их распространения. Было установлено, что наиболее эффективным средством нападения являются бактерии чумы».
Были утверждены и приняты на вооружение три основных метода применения бактериологического оружия, а именно: распыление бактерий с самолетов, сбрасывание бактериологических бомб и метод диверсий. С началом войны предусматривалось распространять на фронте и в тылу противника в больших количествах смертоносные бактерии чумы, холеры, тифа, сапа, сибирской язвы и других заболеваний, заражая населенные пункты, водоемы, колодцы, посевы и скот. Применение бактериологического оружия намечалось на основных стратегических направлениях, соответствующих направлениям главных ударов, намеченных японским планом войны против СССР.
Токийским судебным процессом было установлено, что в 1942 г. отрядами № 731 и № 100 активно велась специальная разведка пограничных районов Советского Союза с целью подготовки к нанесению ударов бактериологическим оружием. В годы войны в диверсионных целях заражались пограничные водоемы в районе Трехречья. На специальном полигоне на станции Аньда проходили «маневры бактериологической войны», в ходе которых использовались специальные аппараты и самолеты. В этих маневрах принимали участие представители штаба Квантунской армии.