После окончательного оформления в России крепостного права (1649 г.) на Дон хлынули закрепощаемые крестьяне и последние вольные люди. Численность донских казаков резко возросла. Новые люди, которые становились казаками, еще не успели обзавестись имуществом, как это было у многих старых казаков. Они пополняли ряды голытьбы. После Азовского осадного сидения турки укрепили выход из Дона в Азовское море, и значительная часть голытьбы стала переволакивать струги на Волгу и выходить в Каспийское море для грабежа морских судов.
Московские власти требовали прекратить эти походы. Казачья верхушка и старые обеспеченные казаки сами неуютно чувствовали себя среди них. Они просили у Москвы дополнительное жалованье для раздачи. Но царское правительство в это время само испытывало затруднения с деньгами. Дополнительного жалованья на Дон не послали. В результате Войско Донское стало волноваться, а крестьяне в Центральной России, угнетаемые помещиками, готовы были поддержать любое выступление казаков против московских властей.
Весной 1667 года начался очередной поход донских казаков на Каспийское море. Во главе его стоял Степан Тимофеевич Разин. Разин происходил из известного на Дону казачьего рода. Крестным отцом Степана был войсковой атаман Корнила Яковлев, прославленный воин. Сам Степан уже стал известен как храбрый воин, удачливый военачальник и умелый дипломат.
Отряд Разина направился на Волгу, силой прорвался вниз по реке мимо Царицына, прошел в Каспийское море и занял правительственную крепость – Яицкий городок, находившийся в устье реки Яик. Перезимовав там, казаки двинулись по морю во владения персидского шаха. Они захватили большую добычу в прибрежных селениях, а зиму провели на Южном побережье Каспия. Весной они разбили посланный против них иранский флот, но, опасаясь новых персидских сил, отошли к Астрахани.
Воевода князь И. Прозоровский опасался, что из-за дальнейших разбоев разинцев на море испортятся русско-иранские отношения, но своих сил для обуздания Разина у Прозоровского не было. Прозоровский предложил казакам «утихомириться и вернуться на Дон». Проходя Астрахань, разинцы щедро раздавали народу деньги и другую добычу. Слава об атамане и его казаках разошлась по всей Волге.
Осенью 1669 года Степан Разин вернулся на Дон, но войска своего на зиму не распустил. В апреле 1670 года Разин с войском явился в Черкасский городок. На Войсковом круге он заявил Корниле Яковлеву: «Ты владей своим войском, а я владею своим войском». Это означало раскол среди донского казачества и потерю Войском Донским прежней власти на Дону.
В мае 1670 года Степан Разин со своим войском вышел на Волгу, захватил Царицын и Астрахань и двинулся вверх по реке. Жители поволжских городов примыкали к Разину и объявляли себя казаками. Повстанцы били бояр и дворян, но не шли против царя. Восстание стремительно разрасталось. Разинцы заняли Саратов и Самару и подошли к Симбирску.
В разгар боев под Симбирском 1–4 октября на помощь осажденному городу подошло войско князя Ю. Барятинского. Разинцы потерпели поражение. Сам атаман 1 октября был «рублен саблею и застрелен из пищали в ногу». Казаки отвезли его в бессознательном состоянии на Дон.
Правительство требовало выдачи Разина. Казачья верхушка решила нарушить неписаный закон казаков – «С Дона выдачи нет». 14 апреля 1671 года Корнила Яковлев и верные ему казаки разгромили разинскую резиденцию, городок Кагальницкий, схватили Степана Разина и выдали его царскому правительству.
6 июня Степана Разина казнили вместе с его братом.
После подавления движения Степана Разина в 1671 году на Дон прибыл полковник Григорий Косагов. Он привел Войско Донское к присяге на верность царю Алексею Михайловичу. Присяга рассматривалась как гарантия верной службы царю, установление более сильной, чем раньше, власти московского правительства над донскими казаками. Однако сношения Дона с Москвой, как и прежде, шли через Посольский приказ, и нигде в грамотах не указывается, что, приняв присягу, донские казаки «учинились в подданстве» России. Многие казаки считали, что, «поцеловав крест Алексею Михайловичу», они дали присягу на верность непосредственно царю, но не России и выполняли те распоряжения, что исходили непосредственно от царя, но не от бояр.
Русское правительство охотно привлекало донцов к любым военным действиям. А войн в тот период хватало. После завершения войны с Польшей в 1667 г. и перехода к России по Андрусовскому перемирию (закрепленному Вечным русско-польским миром 1686 г.) Левобережной Украины и Киева главными противниками России стали Турция и Крым. В 1675 г. донские казаки вместе с запорожцами и калмыками под общим командованием князя К. Черкасского ходили на Крым и разбили войска хана.
Во время Русско-турецкой войны 1676–1681 гг. атаманы Михаил Самаренин и Фрол Минаев руководили донцами в сражении под крепостью Чигирин (в 1678 г.). Другие казачьи отряды ходили морем на крымские и турецкие берега, оказывая помощь русским войскам.
Во время Крымских походов князя В.В. Голицына в 1687 и 1689 гг. казаки сражались и на суше, и на море. Особенно отличился атаман Фрол Минаев, разгромивший в 1687 г. крымских татар у речки Овечьи Воды.
Новый этап в жизни России начался с приходом на престол царя Петра.