Скоро новая экспедиция была готова. Это уже не была та жалкая эскадра, которая вышла в 1492 году из Палоса для поисков Нового Света. Теперь экспедицию составляли 17 больших кораблей. Колумб желал, чтобы в число колонистов назначались только люди, способные к работе и знающие различные промыслы и ремесла. В действительности же благодаря Фонсеке сюда попал самый отчаянный сброд авантюристов, которые ехали в Новый Свет менее всего для того, чтобы работать и культивировать новооткрытые страны, а единственно в надежде награбить там золота и других драгоценностей. Вместе с тем Колумбу был навязан целый штат чиновников для организации управления новыми странами. Ехали также духовные для обращения индейцев в христианство. По желанию Колумба были взяты для акклиматизации в новых странах европейские домашние животные и семена культурных растений Европы.
25 сентября 1493 года экспедиция выступила из Кадиса. 13 октября она покинула Канарские острова. На этот раз Колумб направил свой путь несколько южнее, нежели в первое путешествие. Это привело к открытию Малых Антил. 3 ноября был открыт остров Доминик, затем – Мария Таланта, Гваделупа и другие острова этой группы. 22 ноября эскадра прибыла в Гаити и бросила якорь у того места, где была основана колония в предыдущее путешествие. К удивлению Колумба, никто из оставленных здесь испанцев не вышел на берег даже тогда, когда прибытие эскадры было возвещено пушечными выстрелами. Сойдя на берег, Колумб нашел, что устроенные им дома и крепость разрушены, и на месте их везде валялись остатки трупов. Очевидно, между оставленными колонистами и туземцами возникли враждебные действия, приведшие к полной гибели первых. Скоро явился друг Колумба, касик Гваканагари, и объяснил все происшествие. Оставленные колонисты, вопреки данной ими клятве, после отъезда Колумба стали обращаться с туземцами самым варварским образом: отнимали у них жен, грабили все, что считали ценным, заставляли их работать на себя как рабов, наносили им жестокие побои. Вследствие этого среди туземцев вспыхнуло восстание против белых и их союзника Гваканагари. Так как испанцы, надеясь на превосходство своего оружия и считая туземцев трусами, совершенно не остерегались, то они были поголовно перебиты при неожиданном нападении туземцев. Гваканагари также был ранен и многие из подвластных ему деревень были сожжены. Когда Гваканагари кончил это объяснение, прибывшие с Колумбом гражданские и духовные чины отнеслись к нему крайне подозрительно и предлагали арестовать его как участника в убийстве погибших испанцев. Но Колумб, уверенный в благородстве своего туземного друга, отпустил его с почетом. Однако Гваканагари понял, что надеяться на дружбу испанцев ему нельзя, и на другой день со всеми своими подданными бесследно исчез из прибрежной части острова. Таким образом, Колумбу приходилось теперь начинать свою колонизаторскую деятельность не только без дружеского содействия туземцев, но и при прямо враждебном отношении населения острова.
Высадившись на берег, он решился основать первый город в Новом Свете. Когда стали выгружать с кораблей все бывшее на них, обнаружилось все коварство Фонсеки. Многого необходимого совсем не оказалось, а все, что было, было скверно. Врачи напрасно искали лекарств; их не захватили, хотя за них было заплачено из казны. Когда Колумб осматривал в Кадисе лошадей, назначенных для экспедиции, это были великолепные андалузские кони; на корабли же попали жалкие клячи, годные лишь на убой. Припасы наполовину были совсем испорченные, а остальные – самого плохого качества, инструменты – большею частью никуда не годные. И так во всем. Тем не менее Колумб энергично принялся за основание города, который он назвал Изабеллой в честь испанской королевы. Были выстроены дома, вокруг них разведены сады, на полях посеяны семена европейских хлебов.
Главный труд по устройству города пал на индейцев, так как испанцы работали крайне неохотно, дерзко заявляя, что они прибыли в Новый Свет вовсе не для работ. Колумб старался, чтобы индейцы получали за свой труд вознаграждение, но ему невозможно было за всем усмотреть; к тому же он заболел жестокой лихорадкой и должен был пролежать несколько недель в постели. Пользуясь этим, испанцы силой сгоняли смирных индейцев, как вьючный скот, и заставляли их работать за себя. Все это, конечно, мало могло содействовать образованию хороших отношений между пришельцами и туземцами.
Скоро непривычный климат, неосторожность и невоздержанная жизнь испанцев породили среди них убийственные болезни, положившие начало недовольствам среди колонистов. Они стали роптать, утверждая, что были низко обмануты Колумбом. Авантюристы рассчитывали набрать в Новом Свете без всякого труда массы золота и возвратиться богачами на родину, а тут их заставляют работать, и вместо всех благ они нашли здесь одни ужасные болезни, от которых могут все перемереть. Более нетерпеливые из них стали требовать, чтобы Колумб отправил их обратно на родину.