Первое прямое свидетельство о его гомосексуальных наклонностях появилось во времена пребывания в доме Верроккьо, где он жил вместе с другими мальчиками. Но Леонардо тогда оправдали. Несмотря на то, что большинство современных биографов считают, что толкования о возможных сексуальных контактах между Леонардо и его учениками безосновательны и определенно дезавуируют их, все равно многие полагают возможным, что «нежное отношение» художника к мальчикам, не соответствовавшее тогдашним традициям, выражалось также и не в сексуальных действиях. Это мнение касается по меньшей мере Салаино, которого он, едва встретив, взял к себе в нежном десятилетнем возрасте и несмотря на его лживый и вороватый характер любил и баловал. Они также размышляют об упоминавшейся уже здесь «позорной карикатуре» на листке Codex Atlantikus, которую доставил в его мастерскую один из учеников, она откровенно свидетельствовала о связи мастера и Салаино. Но, тем не менее, современники отметили двойную игру в отношении обоих, о чем уже упоминалось в рассказе Ломаццо.
Охотно поговаривают еще и о том, что одно время Леонардо овладело безграничное чувство мрачного аскетизма и, по Фрейду, это было «примером сознательного отказа от секса». Зигмунд Фрейд в этой связи подчеркивал, что Леонардо в противовес другим великим художникам с удовольствием пытался дать волю своей фантазии в эротических и часто по праву считающихся постыдными изображениях. Фрейд об этом писал: «Оставаясь целомудренным, говорит о желании пребывать в воздержании, и когда б только был один эрос, то все живое не было бы достойным материалом для научных устремлений исследователя». Разумеется, здесь Зигмунд Фрейд заблуждался. Вспомните об упомянутом уже сообщении Ломаццо, где он рассказывал об изображении «„симпатичного мальчика“, который на лбу носил части своего тела… под подбородком находился пенис, а на ушах яички». Однако в своих записях он, преисполненный стыдливости, не избегал эротических намеков и легкомысленные, имеющие неоднозначное толкование шутки не осуждал. Существует также прямая порнографическая сентенция, в которой он откровенно пишет о том, что «женщина, прежде чем попадет на труднопроходимый и вязкий путь, поднимает вверх то спереди, то сзади свое платье. И едва она ощутит прикосновение к влагалищу и заду, трижды изречет истину, в которой только и будет сказано: это трудный проход». В других местах он высмеивал далеких от жизни священников, описывая как их обманывали проститутки, прижимаясь к ним безо всякого стыда.
То, к чему он испытывал чувство отвращения и ненависти, в действительности было гетеросексуальным актом. В качестве доказательства того, что Леонардо испытывал эти чувства, Зигмунд Фрейд привел рисунок, на котором Леонардо представил анатомический разрез совершения полового акта и приписал ему странные заблуждения замещений. Р. Райтлер, анализировавший это своеобразное изображение акта совокупления, писал: «Мужское тело нарисовано во весь рост, а женское только частично. И если беспристрастный наблюдатель представит передаваемый здесь рисунок… он с уверенностью может сказать, что голова выполнена в чисто женском стиле. Вьющиеся кудри как на переднем, так и на заднем плане, опускаясь вдоль спины, характеризуют голову больше как женскую, чем мужскую. Женская грудь показана с двумя изъянами: первый в изобразительном отношении передает контур некрасивой обвисшей груди, второй — в анатомическом плане представляет точный вид грудных сосков кормящей матери, выполненный им только один раз. Бросается в глаза еще и тот факт, что Леонардо не уделил внимания женским гениталиям. И хотя можно признать то, что здесь показаны влагалище, вход, то матка изображена беспорядочными и сбивчивыми линиями. Мужские гениталии Леонардо рисовал намного корректней… Половой акт происходит в положении стоя, отчего можно было бы предположить, что причины этого гротескового изображения находятся в особенно сильных сексуальных замещениях… Черты лица феминизированной головы мужчины свидетельствуют о защите. Брови нахмурены, а взгляд, устремленный в сторону, выражает страх. В действительности, по этому лицу нельзя было бы признать ни радости любовной жертвы, ни блаженства, гарантированного ею, а только лишь гнетущую тяжесть досады и отвращения».