Такое примирение королевы с Дарнлеем, разумеется, не было искренним. Ослепленная страстью и подчинявшаяся зверским и честолюбивым намерениям своего любовника, Мария отправилась в Глазго с целью коварно овладеть доверием Дарнлея и, выказав ему лицемерное участие, привлечь в Эдинбург и здесь предать в руки его врагов. Подобное вероломство кажется невероятным, но письмо к Босуэлу, однако, доказывает это. Она пишет: «Вы принуждаете меня до такой степени притворяться, что я прихожу в ужас; мало того, вы заставляете меня играть роль предательницы; не забудьте, что если бы не желание угодить вам, то я скорее бы решилась на смерть, чем на подобные поступки… Он хочет ехать со мной не иначе как с условием разделить со мной по-прежнему стол и ложе… если я соглашусь на это, то он сделает все, что мне угодно, и последует за мной».
Чтобы достигнуть брака с Босуэлом, Мария Стюарт не побоялась пожертвовать своею честью, обременить свою совесть, подвергнуть опасности свою особу, заглушить в себе голос сострадания и пожертвовать отцом своего сына. «Да простит мне Бог», — говорила она потом, терзаемая угрызениями совести. Вскоре королева перевезла Дарнлея, по совету Босуэла, не в Крэгмилар, а в Керк-оф-Фильд. Несмотря на предупредительность королевы, Дарнлея не покидали подозрения. Все еще слабого от болезни короля поместили в двухэтажном доме Бальфера. Он занял первый этаж, королева же велела поставить свою кровать в комнате, находившейся под спальнею короля. Устроившись таким образом, хотя и неудобно, возле Дарнлея, королева провела несколько ночей под одной с ним кровлей. Босуэл между тем заботился о приготовлениях к убийству. Чтобы обеспечить себе безнаказанность, он подыскал второстепенных помощников. Орудиями его замысла стали: его лакей, портной, привратник, его брат и два головореза из бывших солдат. Босуэл заказал поддельные ключи ко всем дверям дома Бальфера и привез бочонок пороху, который решено было поставить в комнату королевы и поджечь, взорвав дом.
В вечер на воскресенье 9 февраля королева приказала вынести свою новую бархатную постель, находящуюся в комнате короля, и заменить ее старою. Из ее собственной комнаты она приказала вынести богатое кунье одеяло, которое, без сомнения, она не хотела оставлять перед взрывом. Вечер воскресный она провела с королем, уверяя его, что останется ночевать в доме Бальфера. Пока она дружески разговаривала с Дарнлеем, внизу делались приготовления к убийству. Босуэл распределил все роли между соучастниками. В 10 часов вечера, когда все было готово, королева вспомнила, что она должна быть во дворце на свадьбе свой любимой фрейлины. Простившись с королем, она в сопровождении Босуэла и свиты при свете факелов вышла. Дарнлей с печалью и невольным страхом смотрел на ее удаление. Этот несчастный, инстинктивно предугадывая смертельную опасность, искал утешения в Библии, громко читая псалмы. После этого он заснул, положив недалеко от себя в своей комнате пажа Тэйлора.
Между тем Босуэл, пробыв несколько времени на балу, в полночь возвратился. В сопровождении своих соучастников он через сад прошел к дому Бальфера. Двое часовых, узнав его, пропустили их. Обстоятельства заставляют думать, что двое убийц с помощью поддельных ключей проникли в комнату короля. Услыхав шум, Дарнлей набросил на себя шубу и соскочил с кровати, чтобы спастись бегством. Но убийцы схватили его и задушили. Таким же образом был убит и молодой его паж. Потом они перенесли трупы в маленький фруктовый сад, находившийся по соседству, где они и были найдены на следующее утро. Король был в одной рубашке, а шуба лежала возле него. Окончив это преступное дело, один из заговорщиков зажег фитиль, проведенный в бочку пороха, чтобы, взорвав дом, вернее скрыть следы убийства. Босуэл и другие злодеи отошли тогда на некоторое расстояние, дожидаясь взрыва, происшедшего в третьем часу утра. Услышав страшный треск, все бросились бегом в Эдинбург.