В октябре 1500 года Бастидас отплыл из Кадиса на двух кораблях. По достижении берегов Южной Америки Бастидас исследовал около 1000 км побережья Карибского моря, открыл устье реки Магдалены, а также Дарьенский залив и залив Ураба (северное побережье Колумбии). Участники экспедиции первыми исследовали внутренние области континента в районе Сьерра-Невада-де-Санта-Марта. Был вынужден вернуться в Санто-Доминго, предварительно первым из европейцев ступив на Панамский перешеек. За время плавания в 1502 году Бастидас нашёл много золота, но по обвинению в незаконной торговле был арестован губернатором Эспаньолы Франсиском де Бобадилья и отправлен в Испанию. В это же время состоялось ещё несколько не только испанских (основная цель которых состояла в поисках золота, жемчуга и захвате рабов для продажи в Испании), но и португальских экспедиций (Открытие 24 апреля 1500 года Бразилии Педру Алвариш Кабралом, две экспедиции к бразильским берегам 1501–1502 и 1503–1504 годов Гонсало Коэлью с участием Америго Веспуччи), в результате которых стали проясняться очертания северного и восточного побережья нового континента, причём оказалось, что значительная его часть находится южнее экватора, а значит, он не может быть Азией.
Тяжело больного Колумба перевезли в Севилью. Он не смог добиться восстановления дарованных ему прав и привилегий, и все деньги истратил на товарищей по путешествиям.
20 мая 1506 года в Вальядолиде Колумб произнёс свои последние слова: «В твои руки, Господи, я вручаю мой дух». Похоронен в Севилье, но современники почти не заметили его смерти. Огромное значение открытий Колумба для Испании было признано лишь в середине XVI века, после завоевания Мексики, Перу и государств на севере Анд, когда в Европу пошли суда с серебром и золотом.
После смерти Колумба в 1506 году его прах сначала был погребён в Севилье (Испания), но затем император Карл V решил исполнить его предсмертное желание и похоронить его на земле Вест-Индии. Останки Колумба в 1540 году отвезли на остров Эспаньола (так называли в то время Гаити) и похоронили в Санто-Доминго. Когда на рубеже XVIII и XIX веков часть Эспаньолы перешла от испанцев к французам (и стала называться Гаити), прах был перевезён на Кубу в кафедральный собор Гаваны. После изгнания с этого острова испанцев в 1898 году прах мореплавателя снова вернули в Санто-Доминго, а затем – в Севилью.
Однако в конце XIX века во время реставрации кафедрального собора Санто-Доминго, старейшего в Новом свете, был обнаружен ящичек с костями, на котором было написано, что они принадлежат Колумбу. После этого между Севильей и Санто-Доминго возник спор за право считаться местом, где покоится великий мореплаватель.
В 2003 году исследованием этого вопроса занялась группа генетиков и антропологов во главе с профессором судебной медицины Гранадского университета и Академии ФБР в Квантико Хосе Антонио Лоренте. Анализ предполагаемых останков Колумба, эксгумированных в Севилье, показал, однако, что они принадлежат довольно хрупкому 45-летнему мужчине, тогда как Христофор Колумб, напротив, был весьма крепкого сложения, а скончался в возрасте от 55 до 60 лет.
Теперь очередь за исследованием других останков, которые были эксгумированы в октябре 2003 года у основания маяка-памятника Колумбу в Санто-Доминго. При этом нельзя исключить, что останки Христофора Колумба вообще были утеряны в ходе многочисленных переездов.
Колумбу за его великие открытия католическими монархами был пожалован дворянский герб, на котором «замок Кастилии и лев Леона соседствовали с изображениями открытых им островов, а также якорей – символов адмиральского титула». Его сын Диего женился на племяннице герцога Альбы и потребовал от испанской короны предоставления Панамского перешейка (страны Верагуа), открытого его отцом во время последнего путешествия. Споры о статусе этих земель и о правах потомков Колумба на них затянулись почти на 30 лет. В 1536 г. внук Колумба объявил об отказе от притязаний на открытые дедом земли и на доходы с них, за что король Карлос I вознаградил его солидной пенсией c титулами маркиза Ямайки и герцога Верагуа. В дальнейшем эти титулы носили потомки старшей дочери Диего младшие Альвареши, а затем Фитцджеймсы (потомки герцога Бервика). В XIX веке носитель титула «герцог Верагуа» в знак своего происхождения от Колумба сменил фамилию «Фитцджеймс» на «Кристобаль Колон». От младшей дочери Диего происходит гвадалестская ветвь каталонского рода Кардона.
О Колумбе снято множество фильмов. В том числе: английский «Христофор Колумб» (1949 г.), итальянский сериал «Христофор Колумб» (1985 г.), англо-американо-испанского производства «Христофор Колумб: Открытие» (1992 г.), англо-американо-испано-французского производства «1492: Завоевание Рая» (1992 г.).
Памятник Колумбу в Бремерхафене.