Столкновение назревало давно, и дата сражения зависела только от решимости противников. Жизнь престарелого султана подходила к концу, он достиг вершины могущества, но блеск существования омрачала мысль о непобежденном противнике. С водворением кавалеров на Мальте, казалось, наступил выгодный момент, ведь остров был крошечным и готовность врага к войне оставляла желать лучшего. Спустя 42 года после захвата Родоса турки вновь начали агрессию против ордена.
Поводом к походу послужил незначительный эпизод, упомянутый в трудах орденского историка Э. Берга: «План войны, которая бы уничтожила неспокойного врага, созрел у султана, когда вблизи африканского берега орденские галеры захватили большой корабль, нагруженный богатыми товарами для сераля. Любимые жены владыки, лишенные долгожданных сокровищ, бросились к ногам Солимана и просили его отомстить рыцарям. Сейчас же были разосланы приказания и немедленно приготовлены и флот, и армия. Весть быстро разнеслась, и великий магистр тотчас принял все меры к защите ордена. Все отсутствовавшие рыцари прибыли на Мальту; из Италии привезли продукты, военные снаряды, приехали наемники; все способное на военное дело население принялось упражняться во владении оружием».
В 1557 году орден возглавил французский дворянин Жан Паризо де ла Валлетт. Самый знаменитый руководитель братства, личность незаурядная во всех отношениях, он обрел власть в возрасте 67 лет и по тем временам считался стариком. Легенды о нем слагались еще при жизни; барды воспевали заслуги гроссмейстера в балладах, а священники превозносили его христианские добродетели в проповедях.
Орденский историк аббат де Брантон называл ла Валлетта «гасконцем до кончиков ногтей», чья привлекательная внешность дополнялась умом, храбростью и превосходным образованием. Видимо, романтика походной жизни для него была сильней тоски по родине, ведь, став рыцарем, он ни разу не посетил родовое поместье в Тулузе. Благодаря личной отваге и справедливому отношению к подчиненным будущий глава ордена снискал себе непререкаемый авторитет. С годами к смелости, решительности, организаторскому таланту великого магистра добавилась мудрость, в немалой степени обеспечившая победу в борьбе с давним врагом. Во времена его правления неудачей завершились все попытки завладеть островами, поскольку орден обрел единство, а в казну стали регулярно поступать деньги. Тем не менее высадке войск Сулеймана Великолепного рыцари воспрепятствовать не смогли, поскольку не располагали достаточным количеством пушек.
Турецкая армада подошла к Мальте 18 мая 1565 года. Проведя ночь в бухте, на следующий день 180 кораблей с 30 тысячами янычар на борту причалили к берегу.
Турки сумели захватить Сан-Эльмо, правда, осада завершилась со смертью последнего человека из гарнизона. Штурм форта предварял длительный обстрел из пушек, установленных рядом на мысе (ныне Драгут-пойнт) и на оконечности полуострова, там, где впоследствии появился форт Рикасолли.
Осознав бесполезность защиты, рыцари решили покинуть крепость, что не мог одобрить великий магистр. Получив приказ обороняться до последней капли крови, защитники едва не взбунтовались. Поднявшийся ропот был погашен запиской с разрешением уйти всем желающим, но таковых не нашлось.
Слишком дорого обошлись туркам развалины маленькой крепости. Враги потеряли 8 тысяч солдат и командующего алжирской флотилией, легендарного корсара Тургут-раиса, более известного под прозвищем Драгут. Потери ордена были еще тяжелее. Разъяренный глава турецкой экспедиции Мустафа-паша приказал четвертовать оставшиеся на поле боя трупы, укрепить останки на крестах и бросить в море. На следующее утро скорбный караван прибило к замку великого магистра. Возмездием за поругание послужил приказ ла Валлетта обезглавить пленных турок, зарядить их головы в огромные пушки и произвести залп в сторону вражеского стана.
Дымящиеся руины Сан-Эльмо производили настолько гнетущее впечатление, что, увидев их, один из турецких полководцев заподозрил исход следующих сражений и выразил свои чувства по-восточному витиевато: «Можно представить, какое сопротивление мы получим от отца, если ребенок, почти младенец, стоил нам жизни самых лучших солдат!». Под родителем подразумевался Биргу, куда, подавив эмоции, направил войско Мустафа-паша.