Несмотря на кажущееся спокойствие, Мария на самом деле поддалась одному из постоянно возвращавшихся приступов депрессии. Вероятнее всего, он был спровоцирован осознанием того, что обозначали неотвратимо приближавшиеся роды: ее положением династической матки, обеспечивавшей будущее Шотландии. 18 мая Мария сказала французскому послу Мовиссьеру о своем желании вернуться во Францию: либо на три месяца, чтобы оправиться после родов, либо насовсем, навсегда умыв руки от шотландских дел. Летингтон страстно желал последнего, ведь тогда страна перешла бы под контроль регентского совета. Отсутствие твердой руки и постоянно формирующиеся и видоизменяющиеся альянсы знатных родов становились нестерпимыми. И Мовиссьер, и Сесил сочли желание Марии абсурдным и мимолетным капризом.
Подготовленная для родов маленькая комната находилась в юго-западном крыле того, что сейчас именуют Королевским двором в центре дворцового комплекса; ее единственное окно смотрело на юг с крутого обрыва скалы, на которой стоял замок. От внешнего мира комнату отделяли короткий коридор и две смежные комнаты, обеспечивая уединение. Крайняя серьезность, с какой в то время рассматривались роды, подчеркивается тем, что, как только Мария обосновалась в своих покоях со своими служанками, повитухой Маргарет Астин и кормилицей, она составила завещание. Имелись три копии: одна у самой королевы, другую отправили в Жуанвилль на хранение семье Гизов, а третья должна была оставаться у того, кто захватил бы власть в случае ее смерти.
Завещание начиналось вполне обычным образом: все имущество Мария оставляла своему ребенку. Однако на случай смерти их обоих она дала точные инструкции относительно распределения ее личных драгоценностей. Документ представляет собой просто перечень личных вещей Марии, и против каждого пункта на полях королева указывала, что следовало сделать с каждым предметом. Указания, как и сам список, составлены по-французски и засвидетельствованы Мэри Ливингстон, отвечавшей за королевские драгоценности, и Маргарет Карвуд, самой опытной дамой королевской опочивальни, отвечавшей за постельное белье и кружево. Подпись Маргарет Карвуд выписана с большим трудом: возможно, она была неграмотной. Драгоценность «Большой Генрих», подаренную Марии Генрихом II в день ее свадьбы с Франциском II, следовало включить в состав драгоценностей шотландской короны, а семь самых крупных бриллиантов предполагалось сохранить для будущих королев. Интересны предметы, оставленные Дарили. Всего их двадцать шесть: украшенные драгоценными камнями пуговицы и часы с бриллиантами, часы, полученные от Леннокса, и ее обручальное кольцо с рубином — напротив этого пункта Мария приписала в документе: «С ним я вступила в брак; я оставляю его королю, давшему его мне». Два кольца с рубинами и бриллиантами причитались ее свекру и свекрови — графу и графине Леннокс.
На этом завершается список официальных предметов, остальные в большей степени отражают личные пожелания Марии. Много драгоценностей она оставила своим родственникам Гизам, а также незаконнорожденным Стюартам. Драгоценности причитались леди Джейн Стюарт, графине Аргайл, поймавшей упавшую свечу в ночь убийства Риццио; лорду Джону, другому свидетелю резни; ее сводному брату лорду Джеймсу, теперь графу Морею, и верным королеве дворянам.
Наследство, оставленное четырем Мариям, кажется незначительным, если не считать множества драгоценностей, — в основном это вышивки и расшитое постельное белье. Мэри Ливингстон вышла замуж за Джона Семпилла 6 марта 1564 года, королева присутствовала на ее свадьбе и подарила ей подвенечное платье. Мэри Битон стала женой Александра Огилви из Бойна в мае 1566 года, ей королева оставила свои итальянские и французские книги. Мэри Флеминг выйдет замуж за Летингтона 6 января 1567 года. Мэри Сетон, однако, так и не вышла замуж, оставшись верной своей госпоже, и рассталась с Марией лишь в 1584 году, отправившись в монастырь Сен-Пьер в Реймсе, аббатисой которого по-прежнему оставалась тетка королевы Рене де Гиз. Упоминались в завещании и придворные дамы: графиня Атолл, мадам де Бриант, мадам де Кри, а Эрскину из Блэкгрэнджа, на чьей лошади Мария в ночи скакала в Данбар, должна была достаться брошь с сапфиром и жемчугом. Брату Риццио Джузеппе причитались две драгоценности, а кольцо с изумрудом должно быть отдано человеку, чье имя Мария прошептала ему на ухо. Он так и остался неизвестным. Маргарет Карвуд причитался миниатюрный портрет Марии в оправе из бриллиантов, а также серебряная шкатулка. Постельное белье Марии следовало продать, а деньги поделить между тремя служанками, присматривавшими за ним; посуду и мебель также следовало распродать в пользу привратников, грумов и слуг. Наконец, латинские и греческие книги королевы предназначались Сент-Эндрюсскому университету.